馮海燕， 楊曉輝， 岳紅坤， 陸 敏， 李彥楠

(石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊 050035)

款冬花(Farfaraeflos)為菊科多年生草本植物款冬的干燥花蕾，具有潤(rùn)肺下氣、化痰止咳之功效[1]。近年研究表明，款冬花除含有倍半萜、黃酮、生物堿和揮發(fā)油外，還含有酚酸類成分[2]。酚酸是一類具有多種藥理活性的天然產(chǎn)物[3，4]，是款冬花藥效發(fā)揮的一種重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

款冬花中綠原酸[5，6]或沒(méi)食子酸[7]的分析方法已有研究，但同時(shí)對(duì)這兩種酚酸進(jìn)行測(cè)定目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立了同時(shí)測(cè)定款冬花中綠原酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸及阿魏酸4種酚酸的高效液相色譜方法，并對(duì)不同來(lái)源的款冬花藥材進(jìn)行含量比較。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本，島津公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

沒(méi)食子酸(GA，批號(hào)：110831-200803)、咖啡酸(CA，批號(hào)：110885-200102)、綠原酸(CHA，批號(hào)：110753-200413)及阿魏酸(FA，批號(hào)：110773-201012)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，乙酸及其他有機(jī)溶劑均為分析純，水為艾科浦制水機(jī)制超純水。

款冬花藥材購(gòu)自石家莊不同藥店。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取綠原酸6.0 mg，咖啡酸6.5 mg，沒(méi)食子酸6.5 mg、阿魏酸7.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，得單個(gè)酚酸儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱中避光保存。準(zhǔn)確吸取4種儲(chǔ)備液各1 mL于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)將此溶液稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2款冬花樣品溶液的制備準(zhǔn)確稱取款冬花粉末約3.0 g，加入25倍量甲醇，室溫浸泡24 h，在功率200 W的條件下超聲提取2次，每次40 min。合并濾液，減壓濃縮，以流動(dòng)相定容至50 mL，0.45 μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3色譜條件色譜柱：Sepax Gp-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：A-0.5%乙酸水溶液，B -甲醇，梯度洗脫：0～20 min，25%～50%B；20～22 min，50%～25%B；22～27 min，25%B。柱溫：30 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相組成及pH、稀釋溶劑、洗脫方式、柱溫、流速及進(jìn)樣量對(duì)4種酚酸分離效果的影響。結(jié)果表明，洗脫方式和稀釋溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較大。采用不同比例的甲醇-乙酸水溶液作流動(dòng)相等度洗脫時(shí)，要么總的分析時(shí)間較長(zhǎng)，要么時(shí)間適中但4種酚酸間分離度變差，尤其是沒(méi)食子酸和綠原酸間很難較好分離，故實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫方式。分別以甲醇和起始流動(dòng)相作溶劑稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，所得譜圖見(jiàn)圖1?？梢钥闯觯♂屓軇┑牟煌瑢?duì)綠原酸和沒(méi)食子酸的譜峰形狀有明顯影響，以甲醇作溶劑，譜峰前沿出現(xiàn)肩峰，同時(shí)譜峰展寬，而以起始流動(dòng)相作溶劑，峰形變得對(duì)稱、尖銳。這可能與起始流動(dòng)相和甲醇極性相差較大有關(guān)，實(shí)驗(yàn)采用起始流動(dòng)相做溶劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在本文所確定的色譜條件下，4種酚酸得到最佳的分離效果(圖1b)。

圖1 甲醇(a)與流動(dòng)相(b)做溶劑的混合對(duì)照品色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substances diluted with methanol(a) and mobile phase(b)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

精密吸取1.2.1項(xiàng)下不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣分析。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以信噪比(S/N)=3確定各組分的檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種酚酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限

2.3 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取款冬花樣品溶液10.0 μL，按選定色譜條件，平行測(cè)定5次，測(cè)得沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.76%、1.03%、1.21%和0.92%。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取河北產(chǎn)地的款冬花藥材粉末6份，每份約3.0 g，按1.2.2項(xiàng)制備樣品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。4種酚酸測(cè)定結(jié)果的RSD均小于1.60%，表明重復(fù)性良好。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知含量的河北產(chǎn)款冬花粉末約1.5 g，添加含量相當(dāng)?shù)姆铀針?biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.2項(xiàng)提取，1.2.3項(xiàng)測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各組分的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。各組分的平均回收率為92.3%～102.0%，RSD為0.27%～2.70%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度較高。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果(n= 5)

2.6 樣品分析

利用所建立的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)不同產(chǎn)地的款冬花藥材中4種酚酸的含量進(jìn)行分析，結(jié)果列于表3，代表性色譜圖見(jiàn)圖2。由于綠原酸含量較高，其含量測(cè)定需將提取液稀釋1倍。

表3 款冬花中4種酚酸含量測(cè)定結(jié)果(mg/g，n=3)

a:Farfaraefloswas stir-fried with honey.

圖2 四川產(chǎn)款冬花樣品(a)和加標(biāo)樣品(b)色譜圖Fig.2 Chromatograms of samples from Sichuan(a) and the spiked sample(b)

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測(cè)定款冬花藥材中沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸四種中藥活性成分的高效液相色譜方法,為該藥材的多指標(biāo)質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同來(lái)源款冬花中4種酚酸的含量及其總量不等,以綠原酸含量最高，沒(méi)食子酸次之。若以總酚酸含量來(lái)計(jì)，山西(1)產(chǎn)的藥材含量最高，達(dá)到 5.9618 mg/g。