陳玉玲, 麥婉瑩, 王玉婷, 方旖旎, 張 淼, 王 詩, 丁 虹*

(1.武漢大學藥學院，湖北武漢 430072；2.湖北科技學院藥學院，湖北咸寧 437100)

5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)是機體重要的神經介質之一，其受體在中樞神經系統(tǒng)均有分布。研究表明，5-HT與抑郁癥的生成密切相關[1]，因此，測定人體內5-HT的含量具有重要意義。而氟西汀作為5-HT再攝取抑制劑已被廣泛用于抑郁癥的臨床治療。目前生物樣品中5-HT的檢測方法主要有伏安法、毛細管電泳法、高效液相色譜法(HPLC)、色譜質譜聯用法等，其中最常用的是HPLC。但這些方法的樣品處理過程都較復雜，成本高，對儀器設備的要求較高，而且費時[2]。近年來，電化學方法因操作簡單、檢測速度快等優(yōu)點而得到廣泛的應用[3 - 6]。與傳統(tǒng)三電極系統(tǒng)相比，絲網印刷電極具有批量化、小型化、成本低及一次性等特點[7 - 11]。

本研究制備了多壁碳納米管-殼聚糖納米復合材料(Multi-walled Carbon Nanotubes and Chitosan Nano-composites,MWCNTs-CHIN)修飾絲網印刷電極(SPE)，通過循環(huán)伏安法(CV)及方波伏安法(SWV)考察了5-HT在MWCNTs-CHIN/SPE上的電化學特性,并應用于經慢性不可預見性應激抑郁模型(CUMS)造模的抑郁小鼠大腦和血液樣本中5-HT水平的測定。該方法操作簡單、測定快速，樣品無需復雜前處理，可用于大批量實際樣品中5-HT含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及受試動物

EC570電化學工作站(高仕睿聯)；手動絲印臺(武漢三才印刷器材有限公司)；pH計(北京哈納科儀科技有限公司)；PS-10A超聲波清洗器(香港節(jié)康超聲波有限公司)；紫外固化機(保定榮達電子設備有限公司)；烘箱(上海申光儀器儀表有限公司)，掃描電鏡(荷蘭，FEI公司)。

5-羥色胺標準品(Sigma公司)；MWNTs(中國科學院成都有機化學研究所)；殼聚糖(科瑞生物)；絲印碳油墨(Acheson公司)；銀油墨(Acheson公司)；Ag/AgCl油墨(徐州英劍納米科技有限公司)；絕緣油墨(日本JUJO公司)；PVC片材(上海新立醫(yī)療器械有限公司)，其他試劑均為分析純。實驗用水均為二次蒸餾水。

鹽酸氟西汀片(批號：2079A，禮來蘇州制藥有限公司生產，臨用前配制成混懸液)。雄性昆明小鼠，體重20～25 g，購自湖北省疾控中心，實驗前小鼠適應環(huán)境一周。

1.2 實驗方法

圖1 (A)絲網印刷電極(a -PVC板,b -銀導軌,c -參比電極,d-工作電極,e -輔助電極,f-絕緣層)；(B)絲網印刷電極的測定圖Fig.1 (A)Preparation process of screen printed electrode (a -PVC sheets;b -Ag leads;c -reference electrode;d-working electrode;e -auxiliary electrode;f-insulation layer);(B)Determination of 5-HT

1.2.1MWNTs-CHIN/SPE的制備絲網印刷的基本原理[9,10]是絲網印版圖像部分的網孔能夠透過印料漏印在承印物上，印版上其余部分網孔堵死不能透過油墨，因此在承印物(如PVC片材)上形成空白。銀油墨用來印刷制作電極的導軌，碳油墨用來印刷制作輔助電極和工作電極，Ag/AgCl油墨用來印刷制作參比電極。依次印刷銀導軌、工作電極、輔助電極、參比電極后，置70 ℃ 烘箱中烘干，最后印刷絕緣層，紫外烘干[9 - 13]。先用2 g/L MWNTs對工作電極進行修飾，晾干，再滴加0.5% CHIN，晾干后低溫保存?zhèn)溆?。絲網印刷電極結構如圖1A所示，其測定圖見圖1B。

1.2.2抑郁小鼠模型建立及樣品制備參照文獻方法[14 - 17]，采用慢性不可預見性應激抑郁模型(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)，對受試小鼠予以夾尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、45 ℃ 熱烘(5 min)、晝夜顛倒(24 h)、4 ℃ 冰水游泳(5 min)、水平振蕩(30 min)等方法隨機刺激21 d。分別在7 d、14 d、21 d對小鼠進行行為學評價，并處理小鼠。取其新鮮血液，離心取血漿，用兩倍體積的甲醇沉蛋白，離心取上清，制成血樣。取其大腦組織，加入其4倍體積的生理鹽水并勻漿，用勻漿液兩倍體積的甲醇沉蛋白，離心取上清，將甲醇吹干即制成腦樣。血樣和腦樣均冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.35-HT的測定方法采用電化學工作站，以MWNTs-CHIN/SPE測定5-HT，電解液為含不同濃度5-HT的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)。在-0.20～0.80 V(vs.Ag/AgCl)范圍內分別進行循環(huán)伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)掃描，測定多個不同濃度的5-HT，確定5-HT峰電流與其濃度的關系，繪制標準曲線，并用該方法測定上述樣品中5-HT含量。

圖2 裸絲網印刷電極(A)、MWNTs修飾絲網印刷電極(B)和MWNTs-CHIN修飾絲網印刷電極(C)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM images of bare SPE(A),MWNTs/SPE(B)and MWNTs-CHIN/SPE(C)

2 結果與討論

2.1 5-HT的電化學特性

2.1.1電極表征通過掃描電鏡(SEM)分別對裸絲網印刷電極和修飾絲網印刷電極(MWNTs/SPE,MWNTs-CHIN/SPE)進行表征，如圖2所示。結果顯示，裸絲網印刷電極表面的碳墨顆粒相互間關聯較少，整體結構疏松，凹凸不平，不利于5-HT的富集，導致響應信號不夠明顯；而MWNTs/SPE表面有大量的碳納米管，結構較裸電極緊密，具有良好的導電性，但同時由于碳納米管在電解池體系中易脫落，導致電極不穩(wěn)定，影響5-HT檢測的準確性。而MWNTs-CHIN/SPE表面有較大的比表面積，且殼聚糖在電解池體系中易成膜，有利于5-HT在電極表面的富集，促進電子轉移，催化電化學反應，從而提高響應信號。因此選用MWNTs和CHIN共同修飾的絲網印刷電極進行5-HT含量的測定。

2.1.25-HT在MWNTs-CHIN/SPE上的電化學特性采用循環(huán)伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)分別考察了5-HT在裸絲網印刷電極、MWNTs/SPE和MWNTs-CHIN/SPE上的電化學特性。結果顯示(圖3A)，在-0.20～0.80 V電位范圍內，只出現1個氧化峰，表明5-HT在絲網印刷電極上有電化學活性。進一步用SWV法進行測定(圖3B)，可觀察到裸絲網印刷電極在0.30 V處的峰較小(曲線a)，不易觀察；而MWNTs/SPE和MWNTs-CHIN/SPE在0.30 V的峰較為明顯，MWNTs-CHIN/SPE(曲線c)的氧化還原峰信號明顯強于MWNTs/SPE(曲線b)，且5-HT在一定濃度范圍內與響應峰電流呈線性相關，可用于5-HT的測定。研究結果表明經MWNTs-CHIN共同修飾后，絲網印刷電極具有更好的導電性及較大的比表面積，從而提高了5-HT的氧化峰電流。

圖3 10 μmol/L 5-HT在不同電極上的循環(huán)伏安曲線(A)和方波伏安曲線(B)Fig.3 Cyclic voltammetric curves(A) and square wave voltammetric curves(B) of 10 μmol/L 5-HT at different electrodes (a) SPE;(b)MWNTs/SPE;(c)MWNTs-CHIN/SPE.

2.2 實驗條件對5-HT電化學信號的影響

2.2.1緩沖溶液的選擇考察了在NaAc-HAc、PBS、Tris-HCl、檸檬酸-NaAc等緩沖溶液中5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上的電化學響應。結果顯示，當緩沖溶液為 Tris-HCl 時，5-HT的峰電流最大，靈敏度最高。故選擇 Tris-HCl為緩沖溶液。

2.2.2緩沖溶液pH值的影響考察了在不同pH值(6.0～9.0)Tris-HCl 緩沖溶液中5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上的電化學響應。結果表明，當Tris-HCl 緩沖溶液的pH值為6.0～7.5 時，5-HT 的峰電流隨著緩沖溶液pH值的增大而增大；當Tris-HCl緩沖溶液的pH值為7.5～9.0 時，5-HT的峰電流隨著緩沖溶液pH值的增大而減小；即當緩沖溶液pH值為7.5時，5-HT峰電流最大，靈敏度最高(圖4)。故選擇pH=7.5的Tris-HCl 溶液為最佳緩沖溶液。

2.2.3掃描頻率的確定考察了不同掃描頻率(10、15、20、25、30、35、40 Hz)下5-HT的SWV圖。由圖可知，隨著掃描頻率的增加，5-HT的峰電位略微負移，峰電流逐漸增大，考慮其峰形及峰電流，選擇掃描頻率為25 Hz進行測定。

2.2.4富集時間的影響測定了富集時間分別為0、1、2、3、4、5 min時5-HT的SWV圖，如圖5。結果顯示，在前3 min，隨著富集時間的延長，5-HT的氧化峰電流逐漸增加，3 min后峰電流基本保持不變。結合反應時間和靈敏度，選擇開路富集時間為3 min。

2.3 工作曲線和檢出限

采用SWV法，在優(yōu)化條件下對5-HT進行測定，如圖6。結果顯示，在0.01～1.00 μmol/L范圍內，5-HT的峰電流與其濃度呈良好的線性關系，線性方程為：I(μA)=3.7699c(μmol/L)+0.2319，相關系數R=0.9969，檢出限(S/N=3)為0.005 μmol/L。

圖4 緩沖溶液pH對5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上峰電流的影響Fig.4 Effect of buffer pH on peak current of 5 μmol/L 5-HT at MWNTs-CHIN/SPE

圖5 富集時間對5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上峰電流的影響Fig.5 Effect of pre-concentration time on peak current of 5 μmol/L 5-HT at MWNTs-CHIN/SPE

圖6 測定5-HT的方波伏安曲線；內插圖為5-HT的標準曲線Fig.6 Squre wave voltammetric curve of 5-HT;Inset:The standard curve of 5-HTa→h:0,0.010,0.020,0.050,0.100,0.200,0.500,1.000 μmol/L 5-HT,respectively.

2.4 干擾實驗

考察了生物體內常見的有機物和離子對5-HT測定的影響。研究結果表明，5 μmol/L 多巴胺(DA)在0.07 V處有氧化峰，100 μmol/L 尿酸(UA)在0.15 V處有氧化峰，250 μmol/L 抗壞血酸(AA)及250 μmol/L葡萄糖不出峰，而5-HT在0.30 V處出峰，即DA、UA、AA及葡萄糖等不干擾5-HT的測定；其他100倍的金屬離子如Zn2+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+無氧化還原峰，基本上不干擾5-HT的測定(誤差<5.00%)。

2.5 抑郁小鼠大腦和血液中5-HT含量的測定

用CUMS法建立小鼠抑郁模型，分別在第7 d、14 d、21 d對其進行行為學評價，如表1和表2所示，模型組在曠場試驗中的水平和垂直活動得分均顯著低于空白組(P<0.05)，同時，模型組的游泳不動時間顯著高于空白組(P<0.05)，說明造模成功。

表1 小鼠曠場試驗的測定結果

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

表2 小鼠游泳不動時間的測定結果

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

測定小鼠腦樣及血樣的加標樣品的標準曲線，在0.01～1.00 μmol/L濃度范圍內呈線性，其線性方程為：I(μA)=4.4703c(μmol/L)+0.0348，相關系數R=0.9982，檢測限(S/N=3)為0.010 μmol/L，加標回收率為90.1%～112.0%，相對標準偏差(RSD)<5.0%。用上述建立的方法和高效液相色譜法(HPLC)同時測定小鼠大腦和血液樣品中5-HT的含量，如表3和表4所示，用絲網印刷電極和HPLC兩種方法均測得空白組和氟西汀組的5-HT含量明顯高于模型組，同時，上述兩種方法測得的5-HT含量相當，說明絲網印刷電極電化學法測定5-HT的方法準確可行。

表3 小鼠大腦中5-HT含量測定結果(n=5)

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

表4 小鼠血樣中5-HT含量測定結果(n=5)

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

3 結論

本文成功地將MWNTs和CHIN共同修飾在絲網印刷電極表面，制備了修飾絲網印刷電極，并建立了快速測定抑郁小鼠大腦和血液樣品中5-羥色胺含量的電化學分析新方法。該方法簡單、快捷，且電極制作成本低，所需儀器簡單，樣品不需預處理，用于大腦和全血中5-羥色胺含量的測定結果滿意，可作為一次性測試條使用，為5-羥色胺檢測走入小型化、家庭化提供了實驗基礎。