吳芳輝， 程立春， 陳 樂， 蔡征宇

(安徽工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽馬鞍山 243002)

維生素B6(VB6)又稱吡哆素，它是維持人體大腦和生理健康所必需的水溶性B族維生素，同時(shí)VB6還是人體內(nèi)某些輔酶的組成成分，參與人體脂肪、糖、腦細(xì)胞以及氨基酸等各種代謝反應(yīng)。目前關(guān)于VB6的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[1]、液相色譜法[2]、紫外分光光度法[3]、熒光法[4]和電化學(xué)法[5,6]等。其中，電化學(xué)方法操作簡單、快速且成本較低因而在藥物分析中倍受關(guān)注。

納米Cu2O材料因獨(dú)特的性質(zhì)而在太陽能轉(zhuǎn)換[7]、光催化降解[8]和氣體傳感器[9]等方面的應(yīng)用引起了眾多研究者的關(guān)注。但受到其導(dǎo)電性的影響，采用納米Cu2O材料修飾電極測(cè)定藥物分子的文獻(xiàn)較少[10 - 12]。石墨烯(GR)是目前世界上最薄的材料且具有大的比表面積、優(yōu)異的機(jī)械特性和精巧的電學(xué)特性[13,14]。不過單層石墨烯較易團(tuán)聚，堆垛形成多層石墨烯甚至石墨，因此通過化學(xué)法處理石墨烯，在其表面引入活性基團(tuán)來防止團(tuán)聚，增加其溶解性是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。本文通過HNO3+H2SO4混酸氧化石墨烯，再摻雜自制的粒徑均一的納米Cu2O材料，構(gòu)建新型復(fù)合修飾電極，并研究了VB6在該修飾電極上的電化學(xué)行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合修飾電極充分發(fā)揮了氧化石墨烯(GO)和納米Cu2O兩種材料的協(xié)同作用，與單一材料修飾以及裸玻碳電極相比，電催化作用顯著，最后成功用于實(shí)際藥品中VB6的分析測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

CHI660 D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極體系：玻碳電極(GCE)、納米Cu2O/Nafion/GCE、GO/Nafion/GCE或納米Cu2O/GO/Nafion/GCE為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極。Spetrum one型傅里葉變換紅外光譜儀(美國，PE公司)；Hitachi S-4800型掃描電子顯微鏡(日本，日立公司)；pHS-25型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

VB6標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.2060 g VB6標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物藥品制品檢定所)溶于100 mL水中，配制 1.0×10-2mol/L的VB6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱中避光保存，工作溶液通過每天逐級(jí)稀釋獲得。石墨烯購自南京先豐納米材料科技有限公司(純度大于95%)；全氟磺酸離子交換樹脂(Nafion)(5%，V/V)購自中國瑞邦科技有限公司。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 納米Cu2O材料的制備和石墨烯的氧化

在5.0 mL 0.05 mol/L CuCl2溶液中，攪拌下加入5 mL 0.20 mol/L NaOH溶液，繼續(xù)攪拌30 min，再加入5.0 mL 0.07 mol/L L-抗壞血酸并攪拌2 h，可以觀察到反應(yīng)溶液逐漸變?yōu)楹稚珣腋∫?。將得到的褐色沉淀物離心分離，并用二次蒸餾水和無水乙醇清洗至中性，最后將產(chǎn)物于真空干燥箱中干燥12 h，得到納米Cu2O材料。稱取一定量的石墨烯，加入8.0 mL體積比為1∶3的HNO3+H2SO4的混酸后，于50 ℃下水浴加熱并輔以強(qiáng)功率超聲6 h，得到棕色的懸浮液。將懸浮液離心分離并洗滌至中性，最后將得到的固體烘干，即得到氧化石墨烯(GO)。

1.3 修飾電極的制備

將玻碳電極(GCE，Φ=3 mm)分別在HNO3(1+1)、丙酮、乙醇和水中各超聲3 min， 再用0.05 μm Al2O3懸糊液拋光成鏡面后，放入0.50 mol/L H2SO4中，于-1.50～1.50 V進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至循環(huán)伏安圖穩(wěn)定。稱取 1.0 mg納米Cu2O和GO按不同比例混合的復(fù)合材料，加入1.0 mL含0.1% Nafion 的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，超聲震蕩2 h，形成濃度為1 mg/mL穩(wěn)定、均一的納米Cu2O、GO以及Nafion分散液。吸取 8.0 μL分散液涂布在處理過的GCE表面，室溫真空條件下干燥后備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米Cu2O和GO的表征

圖1a為GO的紅外表征圖。可見，在1 722 cm-1和1 626 cm-1處出現(xiàn)了羧基特征吸收峰，在1 118 cm-1處出現(xiàn)了C-O-C特征吸收峰，在3 443 cm-1處出現(xiàn)了羥基特征吸收峰。表明處理后的石墨烯表面存在較多的含氧基團(tuán)，改善了其分散性。從圖1b可見，納米Cu2O材料為形狀比較規(guī)則的正方體顆粒狀，其粒徑大約為100 nm，且相互堆垛在一起。

圖1 GO的紅外光譜圖(a)和納米Cu2O的掃描電鏡(SEM)圖(b)Fig.1 FI-IR spectrum of GO(a) and the SEM image of nano Cu2O materials(b)

2.2 VB6在納米Cu2O和GO修飾電極上的電化學(xué)行為

由圖2中的循環(huán)伏安曲線可以看出，修飾電極在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中于0～0.20 V電位范圍內(nèi)出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰，該氧化峰對(duì)應(yīng)于Cu2O氧化成CuO，還原峰對(duì)應(yīng)于CuO還原成了Cu2O，說明納米Cu2O材料已經(jīng)成功修飾到玻碳電極表面。在加入濃度為5.0×10-5mol/L VB6后，發(fā)現(xiàn)VB6在該修飾電極上沒有還原峰，只在約+0.73 V處有一明顯的氧化峰，表明VB6在修飾電極上發(fā)生了不可逆氧化反應(yīng)。相對(duì)于裸GCE、Cu2O/Nafion/GCE和GO/Nafion/GCE，VB6在Cu2O/GO/Nafion/GCE上氧化峰電流明顯增加，且峰位負(fù)移，證實(shí)GO和納米Cu2O的協(xié)同效應(yīng)促進(jìn)了電子在復(fù)合修飾電極表面的傳遞從而使對(duì)VB6有良好的催化氧化作用。

2.3 pH值的影響

研究了VB6在pH=6.0～8.5的0.1 mol/L PBS中的電化學(xué)行為，結(jié)果如圖3a所示。實(shí)驗(yàn)表明，隨著電解質(zhì)溶液pH值的增加，VB6的氧化峰電流增加且在pH值為7.0 時(shí)達(dá)到最大值，實(shí)驗(yàn)選擇 0.1 mol/L pH=7.0的PBS作為電解質(zhì)并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)還研究了pH值與峰電位的關(guān)系。如圖3b所示，隨著pH值的增大，氧化峰電位發(fā)生負(fù)移，說明VB6的氧化過程有H+的參與，在pH值為6.0～8.5范圍內(nèi)，pH值與氧化峰電位呈線性關(guān)系，其線性方程為：Ep=1.20474-0.06417pH，其斜率為-64.17 mV/pH，接近理論值-59 mV/pH，說明參與電極反應(yīng)過程的質(zhì)子數(shù)和電子數(shù)相同。

圖2 5.0×10-5 mol/L VB6在GCE、Cu2O/Nafion/GCE、GO/Nafion/GCE及Cu2O/GO/Nafion/GCE上于PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of 5.0×10-5 mol/L VB6 on the bare GCE,Cu2O/Nafion/GCE,GO/Nafion/GCE and Cu2O/GO/Nafion /GCE in 0.1 mol/L phosphate buffer solution(pH=7.0)

圖3 緩沖介質(zhì)pH值對(duì)峰電流和峰電位的影響Fig.3 The relationship between peak current (a) and potential (b) with pH values of buffer solution

2.4 納米Cu2O與GO摻雜比及其修飾量的影響

考察了納米Cu2O和GO不同摻雜比例的修飾電極對(duì)測(cè)定VB6的影響，如圖4所示?？梢钥闯?，當(dāng)Cu2O與GO以1∶2的比例混合時(shí)，所構(gòu)建的復(fù)合修飾電極對(duì)VB6的電催化氧化作用最好。固定摻雜比例為1∶2 的Cu2O和GO的分散液用于修飾電極。進(jìn)一步研究了修飾量對(duì)測(cè)定VB6的影響。如圖5所示，隨著修飾量的增加，氧化峰電流隨之增大，這是因?yàn)樾揎楇姌O表面對(duì)VB6的吸附效率隨著修飾量的增加而增加，從而使氧化峰電流增加。當(dāng)修飾劑用量超過 8.0 μL時(shí)，氧化峰電流反而降低，說明此時(shí)修飾膜厚度阻礙了VB6的傳質(zhì)以及與電極之間的電子交換。本實(shí)驗(yàn)選擇修飾劑用量為 8.0 μL。

圖4 不同摻雜比例的Cu2O和GO復(fù)合修飾電極對(duì)測(cè)定VB6的影響Fig.4 The effect of different proportions of Cu2O and GO composites modified electrode for determination of VB6

圖5 修飾量對(duì)VB6氧化峰電流的影響Fig.5 The effect of amount of suspension on peak current of VB6

2.5 富集電位及富集時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1.20～-0.20 V電位范圍內(nèi)，隨著富集電位的負(fù)移，氧化峰電流逐漸增大，而在-0.10～-1.20 V范圍內(nèi)，氧化峰電流又逐漸減小，所以實(shí)驗(yàn)選擇富集電位為-0.20 V。

在選定的富集電位-0.2 V下，當(dāng)富集時(shí)間從2 s增加到60 s時(shí)，VB6溶出峰電流明顯增加，之后電流增加緩慢，這是因?yàn)殡S著富集時(shí)間的增加，電極表面吸附的VB6越多，從而峰電流也明顯的增加，超過了60 s后電極吸附達(dá)到了飽和，峰電流增加緩慢。實(shí)驗(yàn)選擇的富集時(shí)間是60 s。

2.6 掃速的影響

實(shí)驗(yàn)研究了掃描速度在10～300 mV/s范圍內(nèi)VB6在Cu2O/GO/Nafion/GCE上的循環(huán)伏安行為。如圖6所示，隨著掃描速度的增加，氧化峰電流也隨之增加，同時(shí)氧化峰在不斷正移。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)VB6的氧化峰電流與掃描速度在 10～300 mV/s之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程為：ipa(μA)=0.11922+0.7441v1/2((mV/s)1/2)，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，表明VB6在該修飾電極上的反應(yīng)受擴(kuò)散過程控制。

2.7 線性關(guān)系、檢出限及電極重現(xiàn)性

采用示差脈沖伏安法在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)VB6進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)VB6濃度在5.0×10-8～1.5×10-4mol/L范圍內(nèi)與氧化峰電流呈良好的線性關(guān)系(圖7)，其線性回歸方程為:ip(μA)=0.84856+0.18887c(μmol/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.9970，檢出限(S/N=3)為2.1×10-8mol/L。上述結(jié)果證明，該修飾電極對(duì)于VB6的測(cè)定優(yōu)于其它電化學(xué)傳感器[5，6]。

用同一支電極在1 h之內(nèi)對(duì)含2.5×10-5mol/L VB6的溶液進(jìn)行11次平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.8%，表明該修飾電極的重現(xiàn)性好。將該修飾電極在4 ℃下保存3 d，用示差脈沖伏安法測(cè)定的電流仍能達(dá)到原有電流的91%，可見該修飾電極的穩(wěn)定性較好。

圖6 掃速對(duì)峰電流的影響；內(nèi)插圖為峰電流與掃速平方根的校正曲線Fig.6 The effect of scan rates on peak current;Inset is calibration curvefrom top to bottom：10，25，50，75，100，125，150，200，250，300 mV/s.

圖7 VB6在Cu2O/GO/Nafion/GCE上的示差脈沖伏安圖;左內(nèi)插圖為校正曲線Fig.7 Differential pulse voltammograms of VB6 on Cu2O/GO/Nafion/GCE in the phosphate buffer solution(pH=7.0);Inset is calibration curvefrom top to bottom:5.0×10-8,1.0×10-7,5.0×10-7,1.0×10-6,5.0×10ss-6,1.0×10-5,2.0×10-5,5.0×10-5,1.0×10-4,1.5×10-4 mol/L.

2.8 干擾試驗(yàn)

為防止體系中共存物質(zhì)的干擾，在修飾電極構(gòu)建中添加了能對(duì)抗陰離子干擾的Nafion膜[16]，進(jìn)一步研究一些金屬離子和有機(jī)物對(duì)VB6測(cè)定的影響，在允許±5%誤差的范圍內(nèi)，在2.5×10-5mol/L的VB6中加入500倍的Na+、Cl-、K+、葡萄糖，100倍的尿素、抗壞血酸、維生素K1，50倍的Mg2+、Zn2+、Fe3+、Ni2+幾乎無干擾，表明該體系測(cè)定VB6的選擇性較好。

2.9 樣品測(cè)定

采取建立的方法，分別對(duì)市售VB6藥片(南京白敬宇制藥公司生產(chǎn)，標(biāo)示值為10 mg/tablet)和VB6注射液(蕪湖康奇制藥公司生產(chǎn)，標(biāo)示值為50 mg/mL)進(jìn)行測(cè)定。取VB6藥片10片100 mg，研磨后用50 mL蒸餾水超聲溶解，過濾，然后稀釋至100 mL，配制成4.86×10-3mol/L的VB6樣品溶液。取10 μL該溶液和2 μL過濾后的VB6注射液于pH=7.0 PBS中平行測(cè)定8 次。結(jié)果如表1所示。

表1 樣品中VB6的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文研究了VB6在納米Cu2O和氧化石墨烯復(fù)合修飾電極上的電化學(xué)行為，結(jié)果表明，與裸玻碳電極、納米Cu2O以及氧化石墨烯修飾電極相比，VB6在復(fù)合修飾電極上約+0.73 V處產(chǎn)生的氧化峰電流顯著增大，氧化峰電位明顯負(fù)移，說明氧化石墨烯和納米Cu2O復(fù)合后制備成修飾電極發(fā)揮了協(xié)同作用，從而對(duì)VB6的電化學(xué)氧化具有較強(qiáng)的催化作用。氧化峰電流與VB6的濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限達(dá)2.1×10-8mol/L。該方法簡便、快速、靈敏度較高，不僅可推廣用于VB6的在線分析，而且拓展了石墨烯和金屬氧化物納米材料在電化學(xué)傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。