許麗麗， 林澤玲

(韓山師范學院化學系，廣東潮州 521041)

酸性芳香族化合物廣泛存在于各類中草藥、中成藥、西藥制劑和保健食品中，具有抗菌、消炎、止癢、清熱、解毒、抗風濕、麻醉等功效，因此對各類藥物和保健品中有效芳香酸成分和含量的分離分析以及藥物代謝動力學的研究，一直是科研工作者關(guān)注的熱點之一[1 - 4]。目前高效液相色譜法(HPLC)是藥物、食品檢測比較主流的方法[5]。我國藥典中，有超過1 000種藥物的質(zhì)量控制采用了反相高效液相色譜法。C18色譜柱因具有柱效高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣和使用方便等優(yōu)點而成為最常用的反相色譜柱[6]，并已經(jīng)用于多種常見酸性芳香族化合物的分離分析[1 - 3,7]。然而，C18柱分離強極性溶質(zhì)并不理想，單一的疏水作用機制使其對于部分芳香酸的保留時間太短，以致分離度有限從而不得不采用梯度洗脫、離子對試劑或其它更復雜的方法來改善分離效果。因此，開發(fā)更適合分離該類溶質(zhì)的反相色譜固定相十分必要。研究發(fā)現(xiàn)，含有多種作用位點的固定相能與強極性溶質(zhì)發(fā)生多種相互作用，具有良好的色譜分離選擇性，是較理想的分離強極性溶質(zhì)的色譜固定相[8 - 10]。

本實驗室采用中間體法，以5 μm球形硅膠為載體，γ-[(2,3)-環(huán)氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷(KH-560)為偶聯(lián)劑，制備了大黃素鍵合硅膠液相色譜柱(ESP柱)，并展示了ESP柱在極性樣品分離中的良好選擇性[11]。本實驗以14種酸性芳香族化合物為溶質(zhì)，以C18和苯基柱作為參照，側(cè)重考察ESP柱對芳香酸類強極性化合物的分離能力，以及流動相中甲醇含量和pH值對分離的影響，探討其色譜分離機理，為ESP柱的實際應用提供實驗基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜系統(tǒng)(美國，Agilent公司)，包括四元泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器、OpenLAB CDS ChemStation工作站和手動進樣器；ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)，ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)。大黃素鍵合硅膠色譜柱(150×4.6 mm，5 μm，自制)。

甲醇(色譜純，西隴化工股份有限公司)，間苯三酚等酸性芳香族化合物(分析純，上?；瘜W試劑總廠)，其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

復方水楊酸搽劑(上海運佳黃浦制藥有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1ESP柱的制備大黃素鍵合硅膠固定相的制備參照本課題組前期報道的方法[11]，經(jīng)結(jié)構(gòu)表征后，采用勻漿法裝入空色譜柱中，從而制得ESP柱。測得大黃素配體鍵合量為0.23 mmol/g，ESP柱理論塔板數(shù)約為1 9874N/m。

1.2.2色譜分析方法流動相使用前先過濾，再超聲脫氣15 min。溶質(zhì)用甲醇溶解后經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，濃度范圍為50～250 mg/L，進樣體積為5 μL。以甲醇溶劑峰的保留時間為死時間，柱溫為32 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長230 nm，至少平行測定2次。

2 結(jié)果與討論

2.1 ESP對酸性芳香族化合物的分離

2.1.1ESP柱分離間苯三酚等5種酸性混合物由圖1可見，除對甲苯磺酸外，其它4種酸性溶質(zhì)混合物在ESP柱上與在C18柱和苯基柱上的保留順序一致，即間苯三酚<鄰苯二酚<對硝基苯酚

圖1 間苯三酚等5種化合物在ESP柱(a)、C18柱(b)和苯基柱(c)上的色譜圖Fig.1 Chromatograms of m -trihydroxybenzene and other four acidic compounds on ESP(a),C18 (b) and phenyl (c) columnmobile phase:Methanol-0.02 mol·L-1KH2PO4=70∶30(V/V),pH=2.5;1.m-trihydroxybenzene,2.o-dihydroxybenzene,3.p -nitrophenol,4.2-anilinobenzoic acid,5.p -toluene sulfonic acid.

2.1.2ESP柱分離異煙酸等5種酸在相同的色譜條件下，考察了異煙酸等5種芳香酸在ESP柱、C18柱和苯基柱上的色譜行為，如圖2所示。5種芳香酸在C18柱和苯基柱上的保留順序一致、保留時間也較接近。而5種溶質(zhì)在ESP柱上的色譜行為卻顯著不同。由于對氨基苯磺酸中含有磺酸根，在5種溶質(zhì)中極性最強，在C18柱和苯基柱上保留最弱(k′=0.01和0.39)。而在ESP柱上對氨基苯磺酸則是5種溶質(zhì)中保留最強(k′=5.59)的。這是由于ESP柱上的酚羥基、羰基和蒽醌環(huán)與磺酸根發(fā)生了較強的氫鍵作用、偶極-偶極作用和p-π電荷轉(zhuǎn)移等作用，這些作用力的影響遠遠超過了對氨基苯磺酸疏水性的不足。這種現(xiàn)象與前面發(fā)現(xiàn)的ESP柱對對甲苯磺酸的強保留現(xiàn)象相吻合。同時，多種作用位點的協(xié)同作用也使得苦杏仁酸和間苯二甲酸在ESP柱上的保留時間(k′=1.94，3.62)明顯長于C18柱(k′=0.59，1.07)和苯基柱(k′=1.18，1.62)。說明ESP柱具有與C18柱和苯基柱明顯不同的分離選擇性。

圖2 異煙酸等5種酸在ESP柱(a)、C18柱(b)和苯基柱(c)上的色譜圖Fig.2 Chromatograms of isonicotinic acid and other four acidic compounds on ESP(a),C18(b) and phenyl(c) columnmobile phase:methanol-0.02 mol·L-1KH2PO4=50∶50(V/V),pH=2.5;1.isonicotinic acid,2.p -aminobenzoic acid,3.mandelic acid,4.m-phthalic acid,5.p -aminobenzenesulfonic acid.

2.1.3ESP柱分離煙酸等4種酸實驗考察了煙酸、苯甲酸、桂皮酸和對苯二甲酸在ESP柱、C18柱和苯基柱上的分離情況(流動相為甲醇-0.02 mol·L-1KH2PO4體積比55∶45,pH=2.5;圖略)。4種酸在C18柱和苯基柱上的分離主要是基于疏水性順序為：煙酸<對苯二甲酸<苯甲酸<桂皮酸。另一羧基引入苯甲酸會進一步增大其極性，所以在C18柱和苯基柱上對苯二甲酸先于苯甲酸被洗脫。而在ESP柱上，羧基與配體的氫鍵作用和電荷轉(zhuǎn)移作用強于引入羧基帶來的疏水性削弱造成的影響，使得疏水性弱的對苯二甲酸反而比苯甲酸和桂皮酸保留更強。多種作用機制使ESP柱與C18柱和苯基柱對溶質(zhì)的保留具有不同的選擇性，對苯二甲酸在ESP柱(k′=3.03)上的保留強于C18柱(k′=0.51)和苯基柱(k′=1.27)。

2.2 分離酸性芳香化合物的主要影響因素

2.2.1流動相中甲醇含量的影響三組酸性化合物在ESP柱上的保留因子k′與流動相中甲醇含量的關(guān)系如圖3所示。隨著流動相中甲醇含量的增加，大部分溶質(zhì)的保留時間縮短但并不呈現(xiàn)簡單的線性關(guān)系，說明ESP柱對大部分酸性化合物的保留主要是基于疏水作用，但是其它的作用機制對溶質(zhì)在ESP柱上的分離有顯著影響。這表現(xiàn)為：隨著甲醇含量的增加，煙酸與異煙酸在ESP柱上的保留時間不是縮短而是小幅度地增大；對甲苯磺酸的k′與甲醇含量關(guān)系曲線呈現(xiàn)“U”型(與文獻報道[10]的現(xiàn)象類似)；對氨基苯磺酸在ESP柱上的保留基本上不隨甲醇含量的增加而變化。這些異?，F(xiàn)象主要是由于流動相中甲醇含量過高使得流動相實際pH值發(fā)生了較大變化，已不是原來pH=2.5的環(huán)境，同時非疏水作用表現(xiàn)明顯。

圖3 流動相中甲醇含量對溶質(zhì)保留因子的影響Fig.3 The effect of methanol content in mobile phases on the retention factors of the solutesMethanol-0.02 mol·L-1KH2PO4(pH=2.5);(a) peaks identifications are the same as in Fig.1;(b) peaks identifications are the same as in Fig.2;(c):1.nicotinic acid,2.benzoic acid,3.cinnamic acid,4.p-phthalic acid.

2.2.2流動相pH值的影響圖4為三組酸性化合物的保留因子k′隨流動相pH值變化的關(guān)系曲線。由圖可見，由于間苯三酚、鄰苯二酚和對硝基酚的pKa(分別依次為8.45，9.45和7.15)不在所考察的流動相pH值變化范圍之內(nèi)(2.5～6.5)，故其保留因子變化很小。而其它11種芳香酸，其pKa為-2.8～4.92，它們的保留很大程度地取決于本身的pKa及溶液pH值變化。由于以下四種因素的影響，芳香酸在ESP柱上的保留隨pH的變化情況較復雜：(1)隨著pH值的增大，芳香酸溶質(zhì)易電離，極性增強，疏水性降低，保留值減小；(2)隨著pH值的增大，ESP柱固定相中的酚羥基可能發(fā)生解離從而固定相帶負電荷，與羧酸陰離子相排斥，原有的氫鍵作用也大大減弱，從而溶質(zhì)保留值減?。?3)隨著pH值的增大，羧酸陰離子苯環(huán)上的電子云密度大于中性分子，溶質(zhì)與大黃素配體的π-π作用增強，又使溶質(zhì)保留值增大；(4)N-苯基鄰氨基苯甲酸、煙酸和異煙酸分子中含有亞氨基或吡啶環(huán)，隨著pH值的增大，溶質(zhì)分子中的N去質(zhì)子化，溶質(zhì)極性變小，保留變強。圖4顯示，三組酸性化合物在pH=3.5或4.5時各溶質(zhì)分離度相對較好，但實驗發(fā)現(xiàn)間苯二甲酸和對苯二甲酸等溶質(zhì)在pH≥4.5時由于酸解離得不到有效抑制導致色譜峰展寬變形，各溶質(zhì)在流動相pH=2.5時的峰形優(yōu)于pH=3.5時，因此流動相為pH=2.5較適合ESP柱對芳香酸的分離。

圖4 流動相中pH值對溶質(zhì)保留因子的影響Fig.4 The effect of pH value in mobile phase on the retention factors of the solutes Methanol-0.02 mol·L-1 KH2PO4:(a)70∶30,(b)50∶50,(c) 55∶45(V/V);peaks identifications are the same as in Fig.1(a),Fig.2(b) and Fig.3(c),respectively.

2.3 ESP分離實際樣品復方水楊酸搽劑

圖5 復方水楊酸搽劑在ESP柱上的色譜圖Fig.5 Chranatogram of compound salicylic acid liniment on ESPmobile phaste:Methanol-0.02 mol·L-1KH2PO4=65∶35(V/V),pH=2.5；1.m-dihydroxybenzene,2.phenol,3.methyl salicylate,4.salicylic acid.

將復方水楊酸搽劑用甲醇稀釋后過0.45 μm濾膜，然后直接進樣檢測。四種主要成分在ESP柱上的洗脫順序為：間苯二酚<苯酚<水楊酸甲酯<水楊酸(圖5)。而相同條件下，在C18柱和苯基柱上的洗脫順序為：間苯二酚<苯酚<水楊酸<水楊酸甲酯，水楊酸甲酯由于羧基被酯化，疏水性增強，在C18柱和苯基柱比水楊酸保留強。而水楊酸上的羧基與ESP柱存在較強的氫鍵和偶極作用，這種作用強過疏水作用的影響，導致在ESP中水楊酸的保留強于水楊酸甲酯，這與文獻[10]和[12]中的報道相似。而苯基柱由于缺少羥基和羰基等作用基團，氫鍵作用極弱，保留順序與C18柱一致。綜上，ESP柱適合用于復方水楊酸搽劑等酸性實際樣品的分離分析。

3 結(jié)論

上述結(jié)果表明，由于C18柱與溶質(zhì)作用機制單一，在對芳香酸等強極性溶質(zhì)的分離中保留均較弱。苯基柱雖然與溶質(zhì)間除了能發(fā)生疏水相互作用還具有π-π作用，但在對芳香酸的分離中的選擇性和保留強度與C18柱無明顯區(qū)別。而ESP柱對溶質(zhì)的分離主要基于疏水作用，但同時能與溶質(zhì)發(fā)生π-π或p-π電荷轉(zhuǎn)移作用、氫鍵作用以及偶極-偶極作用，其對芳香酸的分離選擇性和保留有別于常規(guī)的苯基和C18柱，可有效用于易電離的芳香酸等極性化合物的分離分析，同時有望作為制備色譜材料用于芳香酸類有效藥物成分的分離、純化和富集。