魏長征　吳宋瑞瑞　蔣麗霞

巰基化透明質(zhì)酸對退變性骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療研究

目的 制備一種具有一定清除自由基能力的巰基化透明質(zhì)酸，為其臨床上治療骨關(guān)節(jié)炎提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法 以透明質(zhì)酸鈉為原料，用 1- （3- 二甲氨基丙基）-3- 乙基碳二亞胺 （EDC）活化羧基，加入帶二硫鍵的化合物——胱胺二鹽酸鹽，使其與透明質(zhì)酸鈉的羧基反應(yīng)交聯(lián)成帶穩(wěn)定二硫鍵的透明質(zhì)酸水凝膠，再用二硫蘇糖醇 （DTT）還原二硫鍵成巰基，制得巰基化透明質(zhì)酸。結(jié)果 該制備得巰基化透明質(zhì)酸的巰基含量平均達到 24.19%。對其進行還原力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力檢測表明，該巰基化透明質(zhì)酸還原力相當(dāng)于同等濃度維生素 C 的 （4.15±0.21）%，對羥自由基的 50% 清除濃度約為5 mg / ml，對鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)也有顯著的抑制作用，加入 10 mg / ml 的該樣品其鄰苯三酚的氧化速率僅為原始自氧化速率的 20% （P＜0.05）。結(jié)論 注射透明質(zhì)酸對關(guān)節(jié)軟骨有很好的潤滑作用，同時用巰基改性后具備較好的抗氧化性能。巰基化合物作為供氫體，去猝滅自由基，自身被氧化成穩(wěn)定的二硫鍵，不會再發(fā)生鏈反應(yīng)。本實驗利用巰基的抗氧化性，改性透明質(zhì)酸鈉，使其具備一定的抗氧化性能，即清除自由基能力，為其臨床的進一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

透明質(zhì)酸；自由基；骨關(guān)節(jié)炎

隨年齡增長，骨關(guān)節(jié)炎 （osteoarthritis，OA）的發(fā)生率明顯增高。骨關(guān)節(jié)炎是在力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下，導(dǎo)致軟骨細胞、細胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者降解和合成正常偶聯(lián)失衡的結(jié)果［1］，其病理特征為關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性退行性病變，并伴有軟骨下骨質(zhì)增生。多年研究發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎與外傷、炎癥、衰老、代謝和免疫等因素有關(guān)。

近年來，隨著逐漸深入研究炎癥反應(yīng)在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用，人們發(fā)現(xiàn)自由基 （free radical）可對關(guān)節(jié)軟骨造成一定程度的損傷，可能參與到骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中［2-5］。關(guān)節(jié)軟骨由維持功能的基質(zhì)及軟骨細胞組成，軟骨基質(zhì)的組成物質(zhì)有膠原、蛋白多糖和水。自由基作用于膠原的氨基酸、脂鏈等，改變了膠原蛋白的一級結(jié)構(gòu)，其二級和三級結(jié)構(gòu)均遭破壞，并發(fā)生變性、疏水性增加、分子聚合（非共價聚合）；或分子間共價鍵形成 （共價聚合）——多聚體；或發(fā)生斷裂，使膠原纖維失去正常的拱形結(jié)構(gòu)及生理功能，造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷。另外，自由基還可通過對細胞生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等的損傷，可引起軟骨細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和功能改變，抑制軟骨細胞蛋白多糖的合成功能，使膠原的分泌由 II 型轉(zhuǎn)變?yōu)?I 型，勢必引起軟骨的損傷退變［6］。

自由基代謝中與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系最密切的是活性氧 （ROS）的代謝［7］。ROS 是由氧形成的幾種活性物質(zhì)的總稱，主要有超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、單線態(tài)氧 4 種，前兩者稱為氧自由基。已證明在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中氧自由基含量升高。自由基反應(yīng)的最大特點是化學(xué)活性強，壽命短，反應(yīng)常呈連鎖性。只要加入少量引起劑，整個反應(yīng)就可啟動，只要加人少量清除劑，整個反應(yīng)就可受到抑制［8］。自由基清除劑是指能清除自由基或能阻斷自由基參與的氧化反應(yīng)的物質(zhì)。目前應(yīng)用的自由基清除劑主要有二大類，一是抗氧化酶，如超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶 （CAT）、谷胱甘肽-過氧化物酶 （GPX）等；二是清除自由基的抗氧化劑類，如維生素 E （Vit E）、維生素 A （Vit A）、維生素 C（Vit C）、β- 胡蘿卜素、還原型谷胱甘肽 （GSH）等活性肽類［7］。

巰基是在生物體內(nèi)天然存在的具有良好生物相容性的官能團，它具有很好的反應(yīng)活性，在相同的條件下其反應(yīng)活性通常比氨基高好幾個數(shù)量級。巰基是一種還原性很高的化學(xué)鍵，可通過簡單氧化得到穩(wěn)定的二硫鍵。這就是巰基化合物作為抗氧化劑通過抑制或減緩自由基的生成來達到抗氧化的目的［9］?，F(xiàn)在較常見的巰基化合物有半胱氨酸、谷胱甘肽 （還原型）等［9］。但是這類化合物均為小分子化合物，在體內(nèi)易代謝，殘存時間短。如何延長體內(nèi)殘存時間，更好地發(fā)揮巰基的抗氧化能力，是這類化合物用于抗氧化應(yīng)用的關(guān)鍵［10］。

透明質(zhì)酸是一種細胞外基質(zhì)中普遍存在的物質(zhì)，廣泛分布于人和動物各組織中，如玻璃體、關(guān)節(jié)滑液、滑膜、軟骨等，是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的重要組成成分。它是由 （1-β-4）D- 葡萄糖醛酸（glucosamine）和 （1-β-3）N- 乙?；?-D- 葡萄糖（glucuronic）交替聯(lián)結(jié)而成的線型多糖，是高相對分子質(zhì)量物質(zhì)。多項研究顯示，透明質(zhì)酸以其物理化學(xué)性質(zhì)及細胞生物學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)，通過覆蓋、潤滑及緩沖關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力，減輕炎癥關(guān)節(jié)內(nèi)反應(yīng)，促進內(nèi)源性大分子透明質(zhì)酸合成分泌［11-16］。本研究利用巰基的抗氧化性及清除自由基能力，改性透明質(zhì)酸鈉，使其具備一定的抗氧化性能，即清除自由基能力，為其臨床的進一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

胱胺二鹽酸鹽、1- （3- 二甲氨基丙基）-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽 （EDC·HCl）、二硫代蘇糖醇 （DTT）（上海金穗生物科技有限公司）；N- 羥基琥珀酰亞胺、1，10- 菲啉·一水、鄰苯三酚 （國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；2，5- 雙 （5- 叔丁基 -1，3- 苯并唑-2- 基）噻酚 （BBOT）（Thermo Scientific 公司）；三氯化鐵·六水 （Aladdin）；鐵氰化鉀、過氧化氫、氫氧化鈉 （上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷 （Alfa Aesar）；氯化鈉 （江蘇省勤奮藥業(yè)有限公司）；鹽酸 （宜興市第二化學(xué)試劑廠）；透明質(zhì)酸鈉（山東華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司）。

紫外-可見光分光光度儀 （UNICO 公司，美國）；元素分析儀 （Thermo Scientific 公司，美國）電子天平 （Mettler-Toledo 公司，瑞士）；恒溫水浴鍋、UXH 漩渦混合器 （上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

二、實驗方法

1. 巰基化透明質(zhì)酸的合成：稱取胱胺二鹽酸鹽0.56 g，EDC·HCl 0.48 g，NHS 0.29 g，依次加入到20 ml 去離子水中，攪拌至溶解，再用 1 M HCl 調(diào)節(jié)pH 值至 5.5。稱取透明質(zhì)酸鈉 （100 萬，Mw）1 g，加入至上述混合液中，攪拌使其完全溶解至均一狀態(tài)。于 4 ℃ 下反應(yīng) 72 h，將所得凝膠切至約 0.2 g 重小塊，于磷酸緩沖液 （0.2 M，pH 7.2）中透析至凝膠重量恒定為止。

稱取 DTT 0.38 g，溶于 10 ml 去離子水中，再加入 10 g 透析后凝膠，用 1 M NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至8.0，攪拌 1 h 至完全溶解。反應(yīng)結(jié)束后，即將反應(yīng)混合物置于透析袋 （截留分子量 14 000 Da），用 2 L0.3 mM HCl 和 0.1 M NaCl 溶液透析 3 天，每 8 h 換1 次透析液；再用 2 L 0.3 mM HCl 溶液透析 2 天，每8 h 換 1 次透析液。最后收集透析袋中的溶液，冷凍干燥得白色絮狀固體。

2. 巰基含量的測定：將上述所合成的巰基化透明質(zhì)酸白色絮狀固體用瑪瑙研缽研磨至細末，隨后放入 105 ℃ 烘箱恒重至干燥，取出放入干燥皿中冷卻 20 min。各精密稱取 3 份 2，5- 雙 （5- 叔丁基-1，3- 苯并唑 -2- 基）噻酚 （BBOT 標(biāo)準(zhǔn)品）和樣品（2.5±0.5）mg，放入錫囊中，擠壓包裹，放入元素分析儀進樣檢測。

巰基含量的計算公式如下：

CS：巰基化透明質(zhì)酸的 S 元素的百分含量；

CN：巰基化透明質(zhì)酸的 N 元素的百分含量。

3. 紅外光譜掃描：利用紅外光譜法對制備的巰基化透明質(zhì)酸樣品進行結(jié)構(gòu)表征。采用 KBr 壓片法，測定樣品的紅外吸收光譜。

4. 還原能力：還原力的測定主要步驟如下：配置 5 mg / ml 的上述合成的巰基化透明質(zhì)酸，梯度稀釋至 5、1、0.5、0.1、0 mg / ml，作為樣品 A；另配置 0.1 mg / ml 維生素 C 溶液作為樣品 B，濃度為0.1、0.08、0.04、0.02、0.01 mg / ml。各取 1 ml 各濃度樣品 A、B 于 10 ml 試管中，依次加入 2.5 ml 鐵氰化鉀溶液 ［ K3Fe（CN）6，1% ］，2.5 ml 磷酸鈉緩沖液（0.2 M，pH 6.6），混勻后在 50 ℃ 保溫 20 min。然后再依次加入 2.5 ml 三氯乙酸 （10%）和 0.5 ml 三氯化鐵 （FeCl3，0.1%）。在 700 nm 處測定混合液的光吸收值。

5. 清除羥自由基能力：羥自由基清除能力的測定如下。首先配置 5 mg / ml 的上述合成的巰基化透明質(zhì)酸，梯度稀釋至 5、2.5、1、0.1、0 mg / ml。取 1 ml 不同濃度樣品，依次加入 1 ml 1，10- 菲啉（1 mM）、1 ml 磷酸緩沖液 （20 mM，pH 7.4）、1 ml硫酸亞鐵銨 ［ FeSO4·（NH4）2SO4·6H2O，0.75 mM ］ 和1 ml 過氧化氫 （0.01%）。反應(yīng)液混勻后，在 37 ℃ 下保溫 1 h。結(jié)束后，代反應(yīng)液冷卻至室溫，測定在536 nm 處的光吸光值。

反應(yīng)混合液的光吸收值降低說明待測化合物有羥自由基清除能力，清除百分率的計算如下：

A536 （樣品）：加 H2O2和待測樣品；A536 （損傷）：加 H2O2和待測樣品；A536 （未損傷）：加待測樣品不加 H2O2。

6. 清除超氧陰離子能力：超氧陰離子自由基（·O2-）的清除能力的測定采用欽傳光等的方法并稍作改進。首先取 0.98 ml 濃度為 10 mg / ml 的巰基化透明質(zhì)酸樣品，加入 5 ml Tris-HCl 緩沖液（0.05 M，pH 8.2），在 25 ℃ 中保溫 10 min，再加入20 μl 鄰苯三酚 （50 mM，用 0.01 M HCl 配置）。立刻測定混合液在 325 nm 處的光吸收，每 10 秒讀一次數(shù)，根據(jù) A325 nm - 時間的關(guān)系計算出鄰苯三酚的氧化速率。對照組中不加待測化合物。待測化合物對鄰苯三酚氧化速率的抑制可以反映出其清除超氧陰離子自由基的能力。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗均重復(fù) 3 次。采用 Origin 9 統(tǒng)計軟件進行分析，同時對數(shù)據(jù)進行線性擬合并考察線性相關(guān)系數(shù)。數(shù)據(jù)以±s 表示，組間比較采用使用 Minitab軟件進行方差分析，檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

結(jié)　果

一、巰基化透明質(zhì)酸的合成

巰基化透明質(zhì)酸的合成路徑圖（圖1），即胱胺上的氨基與透明質(zhì)酸上的羧基在 EDC 的作用下發(fā)生酰胺化反應(yīng)，從而交聯(lián)得由穩(wěn)定二硫鍵連接的透明質(zhì)酸水凝膠。而后，利用二硫蘇糖醇的強還原性質(zhì)，使得二硫鍵斷開形成巰基。

經(jīng)由元素分析儀檢測得該樣品的 N、C、H、S 含量分別為 （5.16±1.01）%、（37.64±1.87）%、（5.40±0.25）%、（3.84±0.73）%。通過元素分析法計算而得，制備樣品的平均巰基含量為 24.19%。

圖1 巰基化透明質(zhì)酸的合成路徑圖Fig.1 The synthetic path of the thiol-modifed hyaluronic acid

二、紅外譜圖

從檢測巰基化透明質(zhì)酸樣品的紅外譜圖（圖2）中可得，與未改性的 HA 相比，3398.8 cm-1與2926.9 cm-1處的吸收峰都有了較大的增強，這是因為酰胺化以及 S-H 的影響。另外，圖中 2562.5 cm-1附近處增加了一個-SH 的伸縮振動峰，說明新物質(zhì)帶有-SH 基團?？烧J(rèn)為成功合成巰基化透明質(zhì)酸。

圖2 巰基化透明質(zhì)酸的紅外譜圖Fig.2 The FTIR spectra of thiol-HA

三、還原能力

具有還原力的樣品使鐵氰化鉀的 Fe3+還原成Fe2+（亞鐵氰化鉀），F(xiàn)e2+（亞鐵氰化鉀）進一步在和三氯化鐵的反應(yīng)下生成在 700 nm 處有最大吸光度的普魯士藍 ｛ Fe4［Fe（CN）6］3｝。

圖3 表示不同濃度的巰基化透明質(zhì)酸與維生素 C 經(jīng)處理后在 700 nm 處產(chǎn)生的吸光值對比。從圖中可以看出，經(jīng)巰基改性后的 HA 呈現(xiàn)一定的還原力，雖然與維生素 C 相比還原力很弱，但是作為高分子物質(zhì)，其在生物醫(yī)用上有優(yōu)于 Vc 的優(yōu)勢。

圖3 各濃度巰基化透明質(zhì)酸與維生素 C 的還原力對比Fig.3 The reducing forces of different concentrations of thiol-HA and vitamin C

四、清除羥自由基能力

鄰二氮菲可與 Fe2+形成絡(luò)合物，此絡(luò)合物在536 nm 處有最大吸收峰，是一常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態(tài)的改變。H2O2/ Fe2+體系可通過 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，鄰二氮菲-Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，其 536 nm 最大吸收峰消失。如果反應(yīng)體系中同時存在羥自由基清除劑，則 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基將被此清除劑全部或部分清除，鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物受到的破壞將會隨之減少。根據(jù)這一原理，可建立以 A536 變化反映自由基清除劑對羥自由基清除作用的比色測定法。

Fe2++H2O2→ Fe3++· OH+OH

Fe2++鄰二氮菲 → Fe2+- 鄰二氮菲 （Amax=536 nm）

· OH+Fe2+- 鄰二氮菲 → Fe3+- 鄰二氮菲

如圖4 所示，各濃度待測化合物均表現(xiàn)出清除Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基的能力，而且其清除作用與濃度成依賴關(guān)系。另外，5 mg / ml 的巰基化 HA能基本達到清除 50% 的羥自由基。

圖4 各濃度巰基化透明質(zhì)酸的羥自由基清除百分率Fig.4 The rate of hydroxyl radical scavenging of different concentrations of thiol-HA

五、清除超氧陰離子能力

在弱堿性條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成·O2- 和有色中間產(chǎn)物，該中間產(chǎn)物在 λ= 325 nm 處有一特征吸收峰。在初始階段，中間產(chǎn)物的量與時間呈線性關(guān)系。當(dāng)加入·O2- 清除劑時，它能迅速與·O2- 反應(yīng)，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，致使溶液在 λ=325 nm 處吸收減弱。故可以通過測定 A325 值來評價清除劑對·O2- 的清除作用。

如圖5 所示，未加巰基化 HA 的對照組中，鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境下發(fā)生自氧化，于 λ=325 nm處產(chǎn)生特征峰，至 10 min 時該吸光值線性增加，并在 30 min 內(nèi)完全被氧化，超氧陰離子被全部釋放。而加入了待測樣品 （濃度為 10 mg / ml 的巰基化 HA）后，自氧化生成的超氧陰離子被大量清除，λ=325 nm 處的特征峰也大大削弱，6 min 后才產(chǎn)生可檢測到的吸光值，圖5 顯示所測樣品對鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)有顯著的抑制作用。此外，根據(jù)初始階段 A325 nm - 時間的關(guān)系計算出鄰苯三酚的氧化速率可知，加入待測化合物后，鄰苯三酚自氧化反應(yīng)的速率均降低。加入濃度為 1、5、10 mg / ml 的檢測樣品后，其氧化速率分別降低至（79.61±4.93）×10-3/ min、（55.18±3.44）×10-3/ min和 （18.22±1.13）×10-3/ min。相比于鄰苯三酚自氧化速率 （89.07±5.56）×10-3/ min，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。

圖5 10 mg / ml 濃度的巰基化透明質(zhì)酸的超氧陰離子清除能力Fig.5 The rate of superoxide anion clearance of 10 mg / ml of thiol-HA

討　論

骨關(guān)節(jié)炎的變化可分成兩個病理過程［17］：（1）關(guān)節(jié)的原發(fā)性增生性改變，主要在軟骨周圍及滑膜；（2）關(guān)節(jié)軟骨的退行性變。骨關(guān)節(jié)炎的特征可概括為：（1）功能退變；（2）軟骨損害；（3）關(guān)節(jié)表面周圍的新骨形成。機械和生物學(xué)因素的相互影響，是它受累的原因。臨床上骨關(guān)節(jié)炎可以分為原發(fā)性和繼發(fā)性，后者引起軟骨退行性變的直接原因為結(jié)構(gòu)改變、炎癥、代謝等；原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎的原因有各種各樣的遺傳因素、環(huán)境因素等，特別是老化過程、正常的磨損、慢性損傷、肥胖、飲食等都可能是發(fā)病因素，從現(xiàn)代生物學(xué)研究表明，細胞因子、生長因子、免疫因素等都與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)。

目前，治療關(guān)節(jié)炎的方法主要有口服止痛藥、人工注射透明質(zhì)酸液或止痛藥、手術(shù)治療以及補充氨糖療法。其中人工注射透明質(zhì)酸液可以潤滑關(guān)節(jié)，暫時控制癥狀，而且透明質(zhì)酸的半衰期只有2～3 天，該方法需不斷補充新的透明質(zhì)酸，但無法逆轉(zhuǎn)病變。另外最有效的補充氨糖療法是根據(jù)骨關(guān)節(jié)炎形成的根本原因，通過外源性的補充氨糖，補充關(guān)節(jié)軟骨合成必要營養(yǎng)，幫助重新長出正常的關(guān)節(jié)軟骨。目前已經(jīng)有 100 多個國家，把氨基葡萄糖療法視為治療膝關(guān)節(jié)炎的最佳方法。

本實驗結(jié)合了人工注射透明質(zhì)酸鈉溶液法和氨糖療補充法兩者的優(yōu)點，制備了一種有治療關(guān)節(jié)軟骨作用的功能化透明質(zhì)酸，既能潤滑關(guān)節(jié)，又能幫助正常關(guān)節(jié)軟骨形成。透明質(zhì)酸是關(guān)節(jié)滑液及軟骨的重要組成部分，研究表明青年人、老年人和骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)透明質(zhì)酸的濃度和分子量呈依次遞減規(guī)律，同時在人進行奔跑即剪切頻率增大時，青年人關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑液呈剪切變稀現(xiàn)象，而骨關(guān)節(jié)炎患者則不會，故其無法起到正常的潤滑作用［18］。另有文獻證明，氨基酸接枝后的透明質(zhì)酸的動力黏度下降明顯，這對覆蓋、潤滑及緩沖關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力，減輕炎癥關(guān)節(jié)內(nèi)反應(yīng)有理論上的輔助作用［19］。本研究利用胱胺的氨基與透明質(zhì)酸的羧基進行酰胺化反應(yīng)，再通過還原二硫鍵使其形成帶還原性能的巰基，從病源上清除患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)高濃度的氧自由基，保護關(guān)節(jié)軟骨，減緩其損傷退變，從而達到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。

骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)高水平的氧自由基主要來源于免疫和炎癥過程中，中性粒細胞、巨噬細胞、炎性滑膜等均可產(chǎn)生過量氧自由基。骨關(guān)節(jié)炎患者的紅細胞內(nèi) SOD （超氧化物歧化酶）明顯下降，血漿 LPO （脂質(zhì)過氧化物）含量明顯增高，二者含量呈負(fù)相關(guān)。而軟骨細胞重復(fù)暴露于過氧化物或超生理范圍的氧壓力下，造成慢性氧化應(yīng)激，可使軟骨細胞過早老化。主要原因是過多產(chǎn)生的氧化劑對軟骨細胞造成了破壞?？梢婋S著年齡增長軟骨細胞老化進一步加速，并提示氧化損傷在這一過程中扮演了一個重要角色。

本研究提供了一種具有抗氧化作用的透明質(zhì)酸鈉衍生物，其凝膠的主體仍然為透明質(zhì)酸鈉，它是人體關(guān)節(jié)潤滑液的主要成分，具有減震、潤滑以及營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨的作用；巰基化透明質(zhì)酸鈉在保持天然透明質(zhì)酸鈉凝膠生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上，還具有清除自由基和抗氧化的活性，利用其巰基的還原性能，進入患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)有一定的清除自由基作用，同時在該氧化環(huán)境中能發(fā)生自身的弱交聯(lián)反應(yīng)，形成較穩(wěn)定的二硫鍵。與非共價鍵相反，二硫鍵不會受到離子強度和 pH 強度的影響。這使得弱交聯(lián)后的透明質(zhì)酸較其本身抗酶降能力更強，體內(nèi)存留時間更長，也對潤滑關(guān)節(jié)軟骨作用有利。此時二硫鍵形成的速度和程度取決于硫負(fù)離子的濃度。硫負(fù)離子的濃度又取決于巰基的 pKa 值、硫醇物和反應(yīng)介質(zhì)的 pH 值。這對巰基 / 二硫鍵的交換反應(yīng)和氧化過程都是有影響的。

巰基化透明質(zhì)酸鈉凝膠具有較好的清除自由基和抗氧化生物活性，同時保留了天然透明質(zhì)酸鈉凝膠獨特的生物學(xué)特性，即良好的黏彈性和生物相容性，能夠起到良好的潤滑、減震以及營養(yǎng)軟骨細胞的作用，對于退變性骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療具有良好的應(yīng)用前景。

［1］Creamer P， Hochberg MC. Why does osteoarthritis of the knee hurt--sometimes？ Br J Rheumatol， 1997， 36（7）：726-728.

［2］張法浩， 王夔. 自由基在大骨節(jié)病病理過程中的作用： IV.在自由基及黃腐酸作用. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 1990， 22（1）：59-61.

［3］Bates EJ， Lowther DA， Handley CJ. Oxygen free-radicals mediate an inhibition of proteoglycan synthesis in cultured articular cartilage. Ann Rheum Dis， 1984， 43（3）：462-469.

［4］Bukhardt H， Schwingel M， Menninter H， et al. Oxygen radicals as effectors of cartilage destruction. Arthritis Rheum， 1986，29（3）：379-387.

［5］孫材江， 王慧. 退行性膝關(guān)節(jié)炎患者氧自由基代謝的觀察. 中華骨科雜志， 1992， 12（6）：433-435.

［6］邵洪， 汪仕良， 尤忠義. 氧自由基與蛋白質(zhì)代謝. 國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊， 1990， 12（1）：42-43.

［7］Li J， Shu Y， Hao T， et al. A chitosan-glutathione based injectable hydrogel for suppression of oxidative stress damage in cardiomyocytes. Biomaterials， 2013， 34（36）：9071-9081.

［8］吳蠡蓀. 自由基與臨床醫(yī)學(xué)（下）. 微循環(huán)學(xué)雜志， 1998， 8（4）：24-26.

［9］Cobo I， Li M， Sumerlin BS， et al. Smart hybrid materials by conjugation of responsive polymers to biomacromolecules. Nat Mater， 2015， 14（2）：143-159.

［10］Yang J， Huang Y， Gao C， et al. Fabrication and evaluation of the novel reduction-sensitive starch nanoparticles for controlled drug release. Colloids Surf B Biointerfaces， 2014， 115：368-376.

［11］Hlavácek M. The role of synovial fluid filtration by cartilage in lubrication of synovial joints-II. Squeeze-film lubrication：homogeneous fltration. J Biomech， 1993， 26（10）：1151-1160.

［12］Huang MH， Yang RC， Lee CL， et al. Preliminary results of integrated therapy for patients with knee osteoarthritis. Arthritis Rheum， 2005， 53（6）：812-820.

［13］Moreland LW. Intra-articular hyaluronan （hyaluronic acid） and hylans for the treatment of osteoarthritis： mechanisms of action. Arthritis Res Ther， 2003， 5（2）：54-67.

［14］Asari A， Miyauchi S， Matsuzaka S， et al. Molecular weightdependent effects of hyaluronate on the arthritic synovium. Arch Histol Cytol， 1998， 61（2）：125-135.

［15］Monfort J， Nacher M， Montell E， et al. Chondroitin sulfate and hyaluronic acid （500-730 kda） inhibit stromelysin-1 synthesis in human osteoarthritic chondrocytes. Drugs Exp Clin Res，2005， 31（2）：71-76.

［16］Bagga H， Burkhardt D， Sambrook P， et al. Longterm effects of intraarticular hyaluronan on synovial fuid in osteoarthritis of the knee. J Rheumatol， 2006， 33（5）：946-950.

［17］Gardner DL. The nature and causes of osteoarthrosis. Br Med J，1983， 286（6363）：418-424.

［18］Balazs EA. Viscoelastic properties of hyaluronic acid and biological lubrication. Univ Mich Med Cent J. 1968： 255-259.

［19］D'Este M， Eglin D， Alini M. A systematic analysis of dmtmm vs edc/nhs for ligation of amines to hyaluronan in water. Carbohydr Polym， 2014， 108：239-246.

（本文編輯：李貴存）

Research on the potential treatment of degenerative osteoarthritis by thiol-modified hyaluronic acid WEI

Chang-zheng， WU Yi， SONG Rui-rui， JIANG Li-xia. Shanghai Qisheng Biological Preparation Co.， Ltd. Shanghai，201106， PRC

ObjectiveTo synthesize a thiol modifed hyaluronic acid with a certain ability of scavenging free radicals and to provide theory basis for the clinical treatment of osteoarthritis. MethodsSodium hyaluronic acid （HA）as raw material， 1- （3-dimethylaminopropyl）-3- ethylcarbodiimide hydrochloride （EDC）was used to activate the carboxyl of HA and cystamin dihydrochloride was introduced to crosslink the HA hydrogel. Subsequently，dithiothreitol （DTT）was used to deoxidize the disulfde linkage into thiol and the thiol-HA was achieved. Results The thiol content of thiol-HA was 24.19%. The reducing capacity， the rate of hydroxyl radical scavenging and the rate of superoxide anion clearance were chosen to evaluate the antioxidant activities of the thiol-HA. The experimental results showed that the reducing force of the thiol-modifed HA was equivalent with （4.15±0.21）% of vitamin C at the same concentration. Meanwhile， the concentration of the thiol-HA at 50% of the hydroxyl free radical scavenging was about 5 mg / ml. 10 mg / ml of the sample was added， the oxidation rate of pyrogallol was decreased to 20% of its autoxidation rate （P＜0.05）. ConclusionsThe articular cartilage is well lubricated by the injection of hyaluronic acid. Better oxidation resistance is achieved by the modifcation of thiol. As a hydrogen donor， free radicals are quenched by thiol compounds which are oxidized to stable disulfide bond without chain reaction. In this research， sodium hyaluronate is modifed by thiol with its oxidation resistance， therefore a certain antioxidant property is achieved with the ability of scavenging free radicals. And a theory basis is provided for the further clinical application.

Hyaluronic acid；Free radicals；Osteoarthritis

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.006

R684.3， R915

上海市產(chǎn)學(xué)研合作項目 （11DZ1921400）

201106 上海其勝生物制劑有限公司

2015-06-11）