閆鈞　趙彥濤　張京　吳琛　陳靜園　張玉梅

antimiR-138 修飾骨髓基質(zhì)干細(xì)胞膜片的可行性及其促進(jìn)同種凍干骨粉成骨的研究

閆鈞趙彥濤張京吳琛陳靜園張玉梅

目的 探索采用非病毒方法轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSC）膜片的可行性；antimiR-138 轉(zhuǎn)染的 BMSC 膜片促進(jìn)同種凍干骨粉 （FDB）成骨的可行性。方法 采用 Vc 連續(xù)誘導(dǎo)法培養(yǎng) BMSC 膜片，通過(guò)調(diào)整 Lipofectamine 2000-miRNAs 載體復(fù)合物的用量及轉(zhuǎn)染步驟對(duì) BMSC 膜片進(jìn)行轉(zhuǎn)染；采用熒光體式及顯微觀察、miRNA-PCR 方法比較各組的轉(zhuǎn)染效率的差異；通過(guò)大體觀察、HE 染色和掃描電鏡觀察 BMSC 膜片的形態(tài)。將 BMSC 膜片 / FDB 復(fù)合物移植到裸鼠皮下，術(shù)后 4～8 周，分別采用 HE 和MT 染色對(duì)膜片的成骨能力進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果 熒光體式及顯微結(jié)果表明 antimiR-138 可成功地轉(zhuǎn)至 BMSC 膜片中，其中 150 nM 組對(duì)內(nèi)源性 miR-138 的抑制率為 85%；體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)表明 antimiR-138 轉(zhuǎn)染的 BMSC 膜片可顯著促進(jìn)并加速移植復(fù)合物的骨組織形成。結(jié)論 （1）通過(guò)對(duì)以 Lipofectamine 2000 為載體的轉(zhuǎn)染復(fù)合物的用量及轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行優(yōu)化，可以構(gòu)建出具有較高轉(zhuǎn)染效率，良好的細(xì)胞相容性以及結(jié)構(gòu)完整的 antimiR-138修飾的 BMSC 膜片。（2）antimiR-138 轉(zhuǎn)染的 BMSC 膜片可顯著促進(jìn)并加速移植復(fù)合物的異位骨組織形成。

間質(zhì)干細(xì)胞；轉(zhuǎn)染；MicroRNAs；移植，同種；骨生成；細(xì)胞膜片

細(xì)胞膜片技術(shù)是指在體外連續(xù)培養(yǎng)高密度接種的細(xì)胞，使其復(fù)層生長(zhǎng)，形成一張富含細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的膜狀結(jié)構(gòu)，并采用非酶解的方式對(duì)其進(jìn)行收獲，因而可完整保存細(xì)胞膜表面蛋白、細(xì)胞-細(xì)胞連接、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)連接等，有利于細(xì)胞功能保存［1-2］，并且可將單張細(xì)胞膜片或?qū)⒍鄰埻N /異種膜片，在體外進(jìn)行三維疊加構(gòu)建工程化組織或直接進(jìn)行缺損修復(fù)［3］。目前細(xì)胞膜片技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于心臟［3-4］、皮膚［5］、角膜［6］以及牙周膜［7-8］等組織與器官的修復(fù)與再生研究，并且某些研究已經(jīng)進(jìn)入臨床使用階段。因此，基于其獨(dú)特的保存細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞間信號(hào)分子、細(xì)胞利用率高和可塑性好等特性，細(xì)胞膜片技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分，并顯示出巨大的臨床應(yīng)用前景。

干細(xì)胞的基因修飾是指將 DNA 或者 RNA 導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)以改變其分化方向或分泌某種蛋白等，從而更好地發(fā)揮干細(xì)胞治療和組織再生的功效［9］。研究發(fā)現(xiàn)，多種小分子核酸，包括 DNA，反義寡核苷酸，siRNA，miRNA 均可通過(guò)特定的途徑轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，發(fā)揮分子水平的治療作用。目前常用的病毒載體雖可高效地轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞并長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)目的基因，但是在臨床上暴露出的免疫原性和致癌性等安全性問題，阻礙著它的進(jìn)一步發(fā)展。非病毒載體不僅免疫反應(yīng)低，而且具有易于體外合成、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，因而基因治療的載體轉(zhuǎn)運(yùn)策略從病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到了非病毒載體系統(tǒng)［10］。目前，盡管基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已在干細(xì)胞的基因修飾中得到廣泛應(yīng)用，然而將其用于細(xì)胞膜片的修飾卻罕有報(bào)道，且局限于一些較復(fù)雜的方法，例如以磁珠修飾的病毒為載體并借助磁力對(duì)膜片進(jìn)行轉(zhuǎn)染［11-12］。因此，若要采用基因工程技術(shù)對(duì)細(xì)胞膜片進(jìn)行修飾，以促進(jìn)其向特定再生目標(biāo)分化，就須尋找一種適用于細(xì)胞膜片轉(zhuǎn)染的簡(jiǎn)單、實(shí)用的方法。

本研究以大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSC）為種子細(xì)胞，采用 Vc 連續(xù)誘導(dǎo)法［13-14］培養(yǎng) BMSC 膜片；以 antimiR-138 為代表，嘗試采用非病毒轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000對(duì) BMSC 膜片進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)對(duì)其轉(zhuǎn)染步驟加以優(yōu)化，以期提高其在 BMSC 膜片中的轉(zhuǎn)染效率，探索非病毒技術(shù)轉(zhuǎn)染 BMSC 膜片的可行性。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)評(píng)估 antimiR-138 修飾的BMSC 膜片 / FDB 復(fù)合體的促成骨能力。

材料與方法

一、主要材料和儀器

α-MEM 培養(yǎng)基 （Gibco BRL，Gaithersburg，MD，美國(guó)）；胎牛血清 （杭州四季青生物工程材料有限公司，浙江，中國(guó)）；L- 抗壞血酸 （Vc）（Sigma，Aldrich，美國(guó)）；LipofectamineTM2000 （Invitrogen，美國(guó)）；Opti-MEM （Gibco，美國(guó)）； miR-138 inhibitor（吉瑪，上海）；miR-138 引物 （銳博，廣州）；PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （Takara，大連）；SYBR Premix Ex TaqTMReal-time PCR 試劑盒（Takara，大連）；HERACELL 細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Thermo，德國(guó)）；AIRTECH 超凈工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備廠）；倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng) （BX50，Olympus Optical，日本）；倒置熒光顯微鏡 （Leica DMI6000B，Leica Microsystems，德國(guó)）；流式細(xì)胞儀 （FACScalibur，BD Biosciences，美國(guó)）；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 （Hitachi S-4800；EIKO Engineering，日本）；實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)系統(tǒng) （CFX96TM，Bio-Rad iQTM5，美國(guó)）。

1 周齡 SD 大鼠，4～6 周齡裸鼠均由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、BMSCs 的分離培養(yǎng)

將 SD 大鼠頸部脫臼處死，分離股骨和脛骨，沖洗出骨髓腔的內(nèi)容物離心棄上清后，加入 10 ml 的α-MEM 培養(yǎng)基重懸，并接種于 75 cm2培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng) 72 h 首次換液，此后每 2 天換液 1 次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶約 85% 時(shí)，0.25% 胰酶消化傳代。第 1～2 代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

三、脂質(zhì)體 miRNAs 載體的制備

本實(shí)驗(yàn)使用的 rno-antimiR-138-5p 以及其對(duì)照組 antimiR-contol 均由上海吉瑪公司合成。根據(jù)前期研究結(jié)果［15］，本實(shí)驗(yàn)制備了四組不同濃度的 miRNA轉(zhuǎn)染的載體混合物，具體配方見表1。

表1 Lipofectamine 2000-miRNAs 載體體系的配比 （μl）Tab.1 Transfection formulations of Lipofectamine 2000-miRNAs （μl）

四、antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片的構(gòu)建及形態(tài)學(xué)觀察

首先將 P1 代的 BMSCs 以 3×105個(gè) / 孔的密度接種到六孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到 100% 時(shí)，將板內(nèi)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液更換為膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液 （10% FBS 的α-MEM+1% 青鏈霉素+50 μg / ml Vc），并連續(xù)培養(yǎng)6 天，每 2 天換 1 次液。第 7 天時(shí)更換板內(nèi)液體為不含抗生素的膜片誘導(dǎo)液，第 8 天加入上述 4 種轉(zhuǎn)染載體混合物，在常規(guī)培養(yǎng)條件下 （37 ℃，飽和濕度，5% CO2）孵育 24 h 完成轉(zhuǎn)染，之后換膜片誘導(dǎo)液繼續(xù)孵育 24 h 完成膜片構(gòu)建。隨后，分別采用體視顯微鏡觀察膜片大體形態(tài)；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察膜片的微觀結(jié)構(gòu)；HE 染色觀察其組織學(xué)形態(tài)。

五、不同濃度 antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片的轉(zhuǎn)染效率

1. 不同濃度 antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片的熒光體式觀察：采用 Cy-3 標(biāo)記 antimiR-138修飾 BMSC 膜片，于熒光體式顯微鏡下觀察并采集圖像。

2. 不同濃度 antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片的熒光顯微觀察：采用 Cy-3 標(biāo)記 antimiR-138 修飾BMSC 膜片，之后用細(xì)胞膜綠色熒光探針 （DIO）標(biāo)記細(xì)胞膜，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

3. miRNA-qPCR 檢測(cè) antimiR-138 修飾的 BMSC膜片的轉(zhuǎn)染效率：提取各組膜片的總 RNA，并測(cè)定 RNA 濃度，選擇 RNA 溶液 A260 / A280 的比值在1.8～2.0 的樣品用于后續(xù)的 PCR 檢測(cè)。采用銳博公司的 miR-138 引物，Takara 公司的 PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及 SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒分別對(duì) miRNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和 Real-time PCR 檢測(cè)，通過(guò)公式 X=2-ΔΔCt計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的miRNA 138 經(jīng) U6 （內(nèi)參）校正后相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。

六、細(xì)胞膜片 / FDB 復(fù)合體的體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)

當(dāng)各組膜片形成后，將兩層同樣的膜片與 FDB骨粉復(fù)合 （圖1），形成 BMSC 膜片 / FDB 復(fù)合體。選取 4～6 周齡 SCID 免疫缺陷鼠，0.1% 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，消毒、鋪巾，分別在左右前后兩側(cè)近四肢皮膚處剪開約 1 cm 的切口，稍作分離后，將三組 BMSC 膜片 / FDB 復(fù)合體植入裸鼠皮下，小針細(xì)線對(duì)位縫合。術(shù)后作好標(biāo)記，繼續(xù)清潔飼養(yǎng)4～8 周取材。移植復(fù)合體經(jīng)多聚甲醛固定后 48 h EDTA 脫鈣后 2～3 周脫水并石蠟包埋，組織切片進(jìn)行 HE 染色及 Masson 三色染色。

圖1 細(xì)胞膜片 / FDB 復(fù)合體的制備過(guò)程Fig.1 Fabrication of the BMSC sheets / FDB complex

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　果

一、antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片的形態(tài)學(xué)觀察

antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片與未經(jīng)轉(zhuǎn)染修飾的 BMSC 膜片在形態(tài)上無(wú)明顯差異。經(jīng)過(guò) 10 天的連續(xù)培養(yǎng)，兩組膜片均形成白色的膜樣結(jié)構(gòu)，并且可以完整地從培養(yǎng)板底部揭起，具有一定的厚度和韌性 （圖2a，b）。對(duì)兩組膜片的縱切面進(jìn)行 HE 染色，結(jié)果顯示兩組膜片均由 6～7 層細(xì)胞組成，厚度約為 （50±5）μm （圖2c，d）。同樣的，膜片的掃描電鏡結(jié)果顯示兩組膜片均含有豐富的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。這表明 antimiR-138 的轉(zhuǎn)染對(duì)膜片的形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。

圖2 antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片與未經(jīng)轉(zhuǎn)染修飾的BMSC 膜片的形態(tài)學(xué)觀察 a～b：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組膜片形態(tài)的體視觀察；c～d：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組膜片形態(tài)倒置顯微觀察 （HE ×400）；e～f：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組膜片形態(tài)的掃描電鏡觀察 （e 掃描電鏡 ×1000；f 掃描電鏡×800）Fig.2 Morphological observation of BMSC sheets transfected with antimiR-138 or not　a-b： Appearance of the BMSC sheets after detachment； c-d： Representative H&E staining images of

二、不同濃度 antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片的熒光觀察

在熒光體式及倒置顯微鏡下，隨著 miRNA 濃度從 50 nM 增至 150 nM，膜片及膜片細(xì)胞中 Cy-3 標(biāo)記的紅色信號(hào)不斷增強(qiáng)，這表明隨著 miRNA 濃度的增加，膜片細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取在不斷增加，而當(dāng)濃度增至 150 nM 時(shí)，細(xì)胞對(duì) miRNA 攝取達(dá)到飽和，即當(dāng)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的濃度增至 200 nM 時(shí)，膜片細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光不再增加 （圖3）。

圖3 不同濃度轉(zhuǎn)染復(fù)合物對(duì) BMSC 膜片轉(zhuǎn)染后 24 h 的熒光體式及熒光顯微觀察 （Cy-3 / DIO 熒光染色 ×400），其中 Cy-3 標(biāo)記的miRNA 顯示紅色熒光信號(hào)，DIO 標(biāo)記的細(xì)胞膜顯示綠色熒光信號(hào)，標(biāo)尺代表100 μmFig.3 Representative fuorescence microscopy images showing the cellular miRNA uptake of BMSC sheets 24 h after transfection with different formulations. The Cy3-labeled miRNAs showed red and the cell bodies were stained with green color. The scale bar indicated 100 μm

三、不同濃度 antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片的 miRNA-PCR 分析

固定轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 antimiR-138 的方法可顯著降低膜片細(xì)胞中內(nèi)源性 miR-138 的含量，并具有濃度依賴性，其中 150 nM 組對(duì)內(nèi)源性 miR-138 的抑制率最高，可達(dá) 85% （P＜0.001）（圖4）。

圖4 不同濃度轉(zhuǎn)染復(fù)合物對(duì) BMSC 膜片轉(zhuǎn)染后 48 h 的 miRNAPCR 檢測(cè)。a，bP ＜ 0.01，0.001 表示與空白對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；cP ＜ 0.01 表示與 50 nM 轉(zhuǎn)染復(fù)合物組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；dP ＜ 0.05 表示與 100 nM 轉(zhuǎn)染復(fù)合物組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Fig.4 The endogenous level of miR-138 assessed by Real Time RTPCR 48 h after transfection.a，bP＜0.01， 0.001 vs the no agent group；cP＜0.01 vs the 50 nM transfection formulation；dP＜0.05 vs the 100 nM transfection formulation

綜合熒光體式觀察、熒光顯微觀察以及 miRNAPCR 的結(jié)果，可以得出 Lipo 2000-miRNA 轉(zhuǎn)染復(fù)合物可順利被 BMSC 膜片所攝取，并且對(duì) miR-138 的抑制具有劑量依賴性，其中 150 nM 組下調(diào) miR-138的效率最高。因此，選擇 150 nM 組進(jìn)行下一步的研究。

四、細(xì)胞膜片 / FDB 復(fù)合體的組織學(xué)觀察

對(duì) 4 周和 8 周取材的移植物分別進(jìn)行 HE 和 MT染色。4 周時(shí)，僅在實(shí)驗(yàn)組移植物的內(nèi)部觀察到了新骨形成，并且在新骨表面可觀察到骨襯里細(xì)胞，新骨的內(nèi)部可觀察到骨陷窩和骨細(xì)胞；而兩個(gè)對(duì)照組內(nèi)雖然有血管的長(zhǎng)入，但仍是以纖維性愈合為主（圖5）。移植后 8 周，實(shí)驗(yàn)組中可觀察到廣泛致密的新骨形成，新骨內(nèi)可觀察到典型的骨陷窩、骨細(xì)胞和骨襯里細(xì)胞并伴有血管生成，其骨形成主要以軟骨內(nèi)骨化為主。與此相反，對(duì)照兩組，新生骨量較少且分布不均，同時(shí)仍有一些纖維結(jié)締組織穿插在新生骨組織中 （圖6）。

圖5 膜片 / FDB 復(fù)合物裸鼠體內(nèi)移植 4 周的顯微染色觀察 （其中 a，b，c HE ×100；d，e，f MT ×100，NB 代表新生骨，CT 代表纖維結(jié)締組織，指示骨細(xì)胞，指示成骨細(xì)胞，代表新生血管）Fig.5 Representative H&E and MT staining images displaying the in vivo bone formation of the BMSC sheets / FDB complex after 4-weeks subcutaneous implantation. Neo-bone formation （NB）， connective tissue （CT）and FDB bone particles （FDB）were indicated. High-magnifcation images showed the osteocytes （）， osteoblasts （） and penetrating blood vessels （）

圖6 膜片 / FDB 復(fù)合物裸鼠體內(nèi)移植 8 周的顯微染色觀察 （其中 a，b，c HE ×100；d，e，f MT ×100，NB 代表新生骨，CT 代表纖維結(jié)締組織，指示骨細(xì)胞，指示成骨細(xì)胞，代表新生血管）Fig.6 Representative H & E and MT staining images displaying the in vivo bone formation of the BMSC sheets / FDB complex after 8-weeks subcutaneous implantation. Neo-bone formation （NB）， connective tissue （CT）and FDB bone particles （FDB）were indicated. High-magnifcation images showed the osteocytes （）， osteoblasts （） and penetrating blood vessels （）

討　論

考慮到細(xì)胞膜片在組織損傷修復(fù)與再生中的巨大的應(yīng)用前景，采用基因技術(shù)對(duì)細(xì)胞膜片進(jìn)行修飾，以提高其再生修復(fù)的效果，是非常有意義的。然而，迄今為止對(duì)于細(xì)胞膜片的基因修飾罕有報(bào)道，且局限于磁力輔助的病毒轉(zhuǎn)染等方法［11-12］。非病毒轉(zhuǎn)染法常規(guī)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染［16］是較為安全可行的，本研究嘗試將其應(yīng)用于細(xì)胞膜片的轉(zhuǎn)染，并對(duì)其可行性進(jìn)行初步探索。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)Lipofactamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑的用量及轉(zhuǎn)染步驟加以優(yōu)化，即可將以 antimiR-138 為代表的 miRNA 成功轉(zhuǎn)入 BMSC 膜片中；并且 antimiR-138 的修飾顯著提高了 BMSC 膜片 / FDB 復(fù)合體的異位成骨能力。

細(xì)胞膜片技術(shù)由于其獨(dú)特的保存細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞表面的蛋白的特性，在組織修復(fù)再生時(shí)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)單細(xì)胞懸液法與生物可降解支架等修復(fù)方式［17-19］。傳統(tǒng)的細(xì)胞膜片培養(yǎng)需要專門設(shè)計(jì)的培養(yǎng)裝置 （如：溫敏培養(yǎng)皿）來(lái)收獲細(xì)胞膜片［20-21］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就如何簡(jiǎn)便、高效地獲得細(xì)胞膜片進(jìn)行了大膽的嘗試，并提出了維生素 C （Ascorbic acid）連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲細(xì)胞膜片的方法，即在培養(yǎng)液中加入維生素 C 或左旋 Vc 磷酸鹽而無(wú)需特殊的設(shè)備［13-14］。研究還發(fā)現(xiàn)利用 Vc 培養(yǎng)的膜片較傳統(tǒng)溫敏法獲得的膜片，具有更好的生物學(xué)性能 （良好的細(xì)胞干性維持、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌增加、可操作性增強(qiáng)等）［13］。本研究嘗試采用 Vc 連續(xù)誘導(dǎo)法構(gòu)建 BMSC 膜片，并驗(yàn)證該方法的可行性。本研究發(fā)現(xiàn)，高密度接種的 BMSCs 通過(guò)在含 Vc 的膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng) 10 天，可形成一張約 50 μm 厚，含 6～7 層細(xì)胞的膜狀結(jié)構(gòu)，并且該結(jié)構(gòu)富含細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞-細(xì)胞間連接蛋白，且易于從培養(yǎng)板底部分離。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)該膜片進(jìn)行 miRNA 修飾后，BMSC 膜片仍能很好地維持其原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)?；诖?，Vc 誘導(dǎo)法可在本實(shí)驗(yàn)中簡(jiǎn)單而有效地構(gòu)建 miRNA 修飾的 BMSC 膜片。

基因治療的載體系統(tǒng)對(duì)于穩(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)染寡核苷酸是必不可少的。盡管病毒載體可高效的轉(zhuǎn)染，并長(zhǎng)期表達(dá)目的基因，但它卻存在嚴(yán)重的安全風(fēng)險(xiǎn)，如細(xì)胞毒性，免疫原性和致瘤性等［22-23］，以及缺乏特異的細(xì)胞靶向性，難以儲(chǔ)存和質(zhì)量控制等一系列問題［24-25］。而非病毒載體似乎更容易克服上述問題［16，26］。本研究擬采用 Lipofectamine 2000 陽(yáng)離子脂質(zhì)體為載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染復(fù)合物對(duì)細(xì)胞膜片轉(zhuǎn)染。這也是迄今為止首次嘗試采用非病毒方法對(duì)細(xì)胞膜片進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為了使細(xì)胞膜片的轉(zhuǎn)染獲得理想的效果，需要對(duì)以 Lipofectamine 2000-miRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物做以下優(yōu)化，并對(duì)其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染流程做一系列的調(diào)整。首先，筆者對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物中Lipofectamine 2000 試劑的用量進(jìn)行了優(yōu)化。通常陽(yáng)離子脂質(zhì)包括 Lipofactamine 2000 在高劑量時(shí)是存在細(xì)胞毒性的［27］，因此要想在對(duì)細(xì)胞膜片進(jìn)行轉(zhuǎn)染的同時(shí)獲得良好的生物相容性，控制轉(zhuǎn)染復(fù)合物中Lipofactamine 2000 的用量是非常必要的。本研究觀察到，當(dāng) Lipofectamine 2000 的用量在 5 μl / 孔時(shí)，在轉(zhuǎn)染后 24 h 導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡 （數(shù)據(jù)未顯示）。（1）本研究采用 4 μl / 孔的 Lipofectamine 2000 用量對(duì)BMSC 膜片進(jìn)行轉(zhuǎn)染，圖2 和圖3 Dio 通道所示，轉(zhuǎn)染后 48 h，膜片中的細(xì)胞生長(zhǎng)良好，沒有出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性。（2）需要對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物中 miRNA 的用量進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最高的轉(zhuǎn)染效率。綜合熒光染色和 miRNA-PCR 的結(jié)果，可以得出 150 nM 組的轉(zhuǎn)染效率最高，其中轉(zhuǎn)染基因?qū)?nèi)源性 miR-138 水平的下調(diào)約為 85%。（3）在使用 Lipofectamine 2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞膜的通透性會(huì)增加，這時(shí)如果有抗生素存在會(huì)影響基因轉(zhuǎn)染效率并導(dǎo)致細(xì)胞毒性，因此需要在轉(zhuǎn)染前 24 h 更換普通的膜片誘導(dǎo)液為無(wú)抗生素的膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)基，從而盡可能地將抗生素從膜片培養(yǎng)液中除去。（4）延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間至 24 h，而非單層細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)推薦的 6 h，以實(shí)現(xiàn)膜片深層細(xì)胞的完全轉(zhuǎn)染。（5）需要強(qiáng)調(diào)的是，在膜片轉(zhuǎn)染的整個(gè)過(guò)程中，都需要使用膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)基而非基礎(chǔ)培養(yǎng)基。筆者之前失敗的結(jié)果表明，如果在膜片轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，最后將無(wú)法形成結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞膜片 （數(shù)據(jù)未顯示）。而在轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)基的使用可以自然地將轉(zhuǎn)染過(guò)程與膜片形成過(guò)程整合在一起，從而成功構(gòu)建出 miRNA 修飾的且具有良好形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜片?？傊?，以上這些方案的調(diào)整可以使 Lipofectamine 2000 為載體的轉(zhuǎn)染復(fù)合物適用于細(xì)胞膜片的轉(zhuǎn)染。使用該方案可以構(gòu)建出具有較高轉(zhuǎn)染效率，良好的細(xì)胞相容性以及結(jié)構(gòu)完整的 antimiR-138 修飾的 BMSC 膜片。

RNA 干擾是指外源或內(nèi)源性 siRNA 或 miRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)能特異地結(jié)合相應(yīng)的靶基因 mRNA，抑制其蛋白的翻譯，從而抑制特定基因表達(dá)的現(xiàn)象。通常 siRNA 會(huì)導(dǎo)致特定靶基因的完全沉默，而miRNA 則可同時(shí)作用于多個(gè)基因并抑制其表達(dá)［28］。miRNA 可調(diào)控細(xì)胞功能的表達(dá)，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種代謝過(guò)程［29］。不同的 miRNA 能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞 （MSCs）向不同方向進(jìn)行分化，其中包括干細(xì)胞的骨向分化［28，30］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-138 是間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的負(fù)向調(diào)控因子，使用 antimiR-138 抑制內(nèi)源性 miR-138 的水平后，可提高干細(xì)胞的體內(nèi)成骨能力［30］。本課題組之前的研究也表明，將 antimiR-138 加載到細(xì)胞培養(yǎng)板或鈦片表面對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行反向轉(zhuǎn)染，可顯著促進(jìn) BMSCs 的成骨分化［15］。本實(shí)驗(yàn)中膜片 / FDB復(fù)合物的異位成骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，antimiR-138 轉(zhuǎn)染的 BMSC 膜片可顯著促進(jìn)并加速骨組織形成。盡管三組移植復(fù)合物均有促血管生成的能力，但三組的促成骨能力卻表現(xiàn)出巨大差異：術(shù)后 4 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組移植復(fù)合物內(nèi)已經(jīng)開始有鈣化軟骨、骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞生成，但此時(shí)兩對(duì)照組中除一些纖維結(jié)締組織外，未觀察到骨組織的再生。術(shù)后 8 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組移植復(fù)合物內(nèi)的新生骨不斷改建并礦化成熟，形成大量致密且分布均勻的骨組織，且在其中可觀察到典型的骨陷窩和骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞并伴有血管的再生。與此相反，兩對(duì)照組中僅表現(xiàn)出少量的新骨形成與血管再生，同時(shí)一些纖維結(jié)締組織仍然殘留在新生骨組織中。綜上所述，antimiR-138-BMSC 膜片 / FDB 復(fù)合物在體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)秀的促新骨形成能力，這一技術(shù)將為骨缺損的修復(fù)和再生提供新的思路和方法。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)以 Lipofectamine 2000 為載體的轉(zhuǎn)染復(fù)合物進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建出具有較高轉(zhuǎn)染效率，良好的細(xì)胞相容性以及結(jié)構(gòu)完整的 antimiR-138 修飾的BMSC 膜片。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，antimiR-138 可有效促進(jìn) BMSC 膜片 / FDB 復(fù)合物的異位骨形成。該技術(shù)為骨缺損的修復(fù)和再生提供新的思路和方法。

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（本文編輯：李貴存）

Fabrication of antimiR-138 delivered mesenchymal stem cell sheet and its effects on freeze dried allograft bone

osteogenesis

YAN Jun， ZHAO Yan-tao， ZHANG Jing， WU Chen， CHEN Jing-yuan， ZHANG Yu-mei. The second Artillery Engineering University， Xi'an， Shaanxi， 710025， PRC

ZHANG Yu-mei， Email： wqtzym@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo verify the feasibility of transfecting the bone mesenchymal stem cells （BMSC）sheets with the non-viral way and to confirm the osteogenesis enhancing effects of antimiR-138 delivered BMSC sheet / freeze dried bone （FDB）complex. MethodsA continuous vitamin C inducing method was used to culture the BMSC sheets， which were later transfected with different Lipofectamine 2000-miRNA lipoplexes. The transfection efficiencies of different formulations were assessed by the miRNA RT-PCR. H&E staining and SEM observation were performed to evaluate the harvested sheets. The ectopic bone regeneration ability of the BMSC sheet / FDB complexes were assessed in immunocompromised mice： H&E or Masson's Trichrome staining were used to assess the osteogenesis of the BMSC sheet / FDB complexes in SCID mice 4 and 8 weeks after implantation. ResultsThe BMSC sheets were fabricated by a vitamin C inducing method. They could be successfully transfected with antimiR-138 to achieve a transfection effciency of nearly 85% by a Lipofactamine2000 based transfection formulation after proper adaption and optimization. The in vivo ectopic bone regeneration results confrmed the robust enhancing effects of antimiR-138 transfection on the bone regeneration ability of BMSC sheets combined with freeze dried allograft bone. Conclusions（1）Satisfactory transfection effciency of nearly 85%， good cytocompatibility and unimpaired cell sheet structure can be obtained by properly optimizing the Lipofactamine 2000 based transfection formulation. （2）The antimiR-138 transfection signifcantly enhances the osteogenesis of the BMSC sheet/FDB complexes in vivo， showing great clinical signifcance for bone repair and regeneration.

Mesenchymal stem cells；Transfection；MicroRNAs；Transplantation， homologous；Osteogenesis；Cell sheets

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.007

R318

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81501611），（81470785）

710025西安，第二炮兵工程大學(xué)校務(wù)部 （閆鈞、陳靜園、吳琛、張京）；710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科 （張玉梅）；100048北京，北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心 （趙彥濤）

張玉梅，Email： wqtzym@fmmu.edu.cn

2015-08-04）