裴愛(ài)月 樸美花 劉 楠 徐珊珊 馮春生 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，全麻能夠增加阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，加重AD的神經(jīng)病理改變〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和自由基損傷與AD神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)〔2〕;臨床相關(guān)濃度的吸入麻醉藥異氟烷能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加劇AD神經(jīng)病理進(jìn)程〔3〕，但其機(jī)制是否與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。海藻糖是一種天然的細(xì)胞保護(hù)劑，具有抗氧化應(yīng)激損傷能力，可以保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗多種有害刺激和損傷(如脫水、氧化應(yīng)激、高溫等)〔4〕，但海藻糖能否治療/減輕吸入麻醉藥異氟烷對(duì)AD的神經(jīng)毒性作用尚不清楚。本研究擬應(yīng)用轉(zhuǎn)淀粉樣前體蛋白(APP)基因小鼠的體內(nèi)AD模型，探討異氟烷對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬氧化應(yīng)激損傷的影響及海藻糖的干預(yù)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和藥品 DNA末端轉(zhuǎn)移酶介異的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Roche公司;海藻糖(trehalose)、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;異氟烷購(gòu)于美國(guó)雅培公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司。兔抗鼠SOD、GSHPx、CAT多克隆抗體購(gòu)自 Abcam公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 12月齡轉(zhuǎn)基因APP小鼠60只(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，雌雄各半，體重20～30 g?；\養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食，室溫保持在18℃ ～25℃，隨機(jī)將小鼠分為四組(n=15):正常對(duì)照組(Control組)、異氟烷組(Iso組)、異氟烷+海藻糖組(Iso+Tre組)、海藻糖組(Tre組)。Iso組小鼠在自制的透明麻醉箱中實(shí)施麻醉，麻醉箱有兩個(gè)側(cè)孔，一側(cè)孔連接麻醉機(jī)，持續(xù)通入流量2 L/min的O2，通過(guò)調(diào)節(jié)麻醉?yè)]發(fā)罐吸入異氟烷，另一側(cè)孔接氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)流出氣體中異氟烷、O2和CO2濃度。脈搏血氧飽和度探頭貼于小鼠腹部監(jiān)測(cè)血氧飽和度、心率。吸入3%異氟烷麻醉誘導(dǎo)，待翻正反射消失后調(diào)節(jié)揮發(fā)罐使麻醉箱內(nèi)異氟烷濃度為1.4%，異氟烷麻醉2 h后吸入100%氧氣，待動(dòng)物蘇醒后返回飼養(yǎng)籠中;Iso+Tre組，小鼠于麻醉前30 min腹腔注射海藻糖400 μg/kg，然后給予1.4%異氟烷麻醉2 h;Tre組，小鼠腹腔注射海藻糖400 μg/kg處理;正常對(duì)照組小鼠不給任何藥物，在麻醉箱持續(xù)通入流量2 L/min的O2處理2 h。

1.3 Morris水迷宮檢測(cè) 每組各隨機(jī)抽取5只轉(zhuǎn)APP基因小鼠于麻醉后24 h開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)指標(biāo):①定位航行實(shí)驗(yàn)。前5 d連續(xù)進(jìn)行，1次/d，分別從四個(gè)象限將小鼠頭朝池壁入水，自動(dòng)攝像系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)記錄到的每只小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期，若90 s后仍不能找到平臺(tái)，以90 s計(jì)算。小鼠如找不到平臺(tái)應(yīng)引導(dǎo)小鼠至平臺(tái)停留15 s。②空間搜索實(shí)驗(yàn)。第6天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，將小鼠按照Ⅰ-Ⅱ-Ⅲ-Ⅳ象限的順序從各入水點(diǎn)放入水池，記錄小鼠120 s內(nèi)在原平臺(tái)所在象限的滯留時(shí)間，即為空間探索時(shí)間。

1.4 海馬內(nèi)活性氧(ROS)測(cè)定 各組小鼠麻醉后6 h殺鼠取海馬組織，加入勻漿緩沖液冰上勻漿，制成10%組織勻漿，離心，取上清液，加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA熒光探針溶液，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次。細(xì)胞經(jīng)1000 r/min離心5 min，去掉上清后，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCFH熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

1.5 海馬MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性檢測(cè) 各組小鼠麻醉后6 h殺鼠取海馬組織，加入勻漿緩沖液冰上勻漿，制成10%組織勻漿，離心，取上清液，待測(cè)，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。海馬MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性的測(cè)定操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用熒光分光光度儀測(cè)定各管吸光度，計(jì)算出MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)海馬MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT的表達(dá) 小鼠麻醉后6 h每組隨機(jī)抽取6只小鼠，制作海馬冰凍組織切片。4%多聚甲醛心臟灌流固定后取腦，浸泡在4%多聚甲醛中4℃過(guò)夜，蔗糖溶液梯度脫水，液氮速凍30 s后－80℃冰箱保存。－20℃冰箱復(fù)溫后，取7 μm的冠狀位腦片，每隔6片選一片，每只小鼠選用3張腦片，－20℃丙酮固定。將腦片用PBS漂洗3 min×3次，浸入0.01 mol/L(pH6.0)的檸檬酸鹽緩沖液中微波修復(fù)抗原，中火6 min×4次，自然冷卻至室溫后PBS洗滌3 min×3次;3%H2O2室溫處理10 min，PBS洗滌3 min×3次;1%TritonX-100(三硝基甲苯)處理標(biāo)本30 min后PBS漂洗3 min×3次;5%羊血清室溫封閉30 min，甩去多液體，勿洗;加入一抗50 μl在4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，37℃復(fù)溫，PBS洗滌5 min×5次;加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體)，37℃孵育 30 min，PBS洗5 min×5次;加入 SP(鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶)，室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，梯度酒精脫水，二甲苯通透2次，中性樹(shù)膠封片保存。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同。計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞數(shù)，每張腦片選取3個(gè)區(qū)域，在400倍顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核被染成黃色或棕黃色即為陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量區(qū)域內(nèi)MDA、SOD、GSH-Px和CAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并拍照。

1.7 TUNEL染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡 異氟烷麻醉結(jié)束后6 h，每組隨機(jī)抽取6只小鼠，制作海馬冰凍組織切片。室溫下3%H2O2處理標(biāo)本10 min，PBS緩沖液洗2 min×3次;蛋白酶K 37℃孵育30 min，PBS洗滌2 min×3 次;加入50 μl TUNEL 反應(yīng)混合液(2 μl TdT 酶+48 μl熒光素標(biāo)記的 dUTP)，37℃ 于暗濕盒中孵育1 h，PBS洗2 min×3次，加50 μl轉(zhuǎn)化劑過(guò)氧化物酶(POD)，37℃濕盒中孵育 30 min，PBS 洗滌 2 min×3 次;50 μl DAB顯色，蘇木素復(fù)染1 min，乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察凋亡細(xì)胞，以鏡下出現(xiàn)凋亡小體，染色質(zhì)呈塊狀凝聚或核裂解及核周新月體樣聚集的細(xì)胞，為陽(yáng)性染色細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率(%)=(計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，異氟烷組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，空間探索時(shí)間明顯縮短〔(27.8±5.2)vs(41.2±8.3)s〕(P＜0.05);與異氟烷組比較，異氟烷+海藻糖組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，空間探索時(shí)間明顯延長(zhǎng)〔(38.4±7.4)s〕(P＜0.05)。見(jiàn)圖 1。海藻糖組空間探索時(shí)間為(44.7±8.8)s。

圖1 吸入麻醉藥異氟烷和(或)海藻糖對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠逃避潛伏期的影響(Morris水迷宮)

2.2 各組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡率的變化 正常對(duì)照組和海藻糖組海馬神經(jīng)元凋亡率為5.3% ～0.38%、2.5% ～0.32%;與正常對(duì)照組比較，異氟烷組海馬神經(jīng)元凋亡率為28.21% ～0.37%，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05);異氟烷+海藻糖組海馬神經(jīng)元凋亡率為15.32% ～0.22%，與異氟烷組比較，其細(xì)胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠海馬神經(jīng)元凋亡的變化(TUNEL法，×400)

2.3 各組海馬組織ROS含量的變化 與正常對(duì)照組(710.3±60.4)比較，異氟烷組海馬組織ROS水平(920.2±90.3)明顯增高(P＜0.05)，海藻糖組海馬組織ROS水平(570.1±40.2)降低(P＜0.05);與異氟烷組比較，異氟烷+海藻糖組海馬組織ROS水平(759.6±69.8)降低(P＜0.05)。

2.4 各組海馬組織MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性的變化 與正常對(duì)照組比較，異氟烷組海馬組織MDA含量明顯增高，SOD、GSH-Px、CAT 活性明顯降低(P＜0.05)，海藻糖組海馬組織 MDA 含量降低，SOD、GSH-Px、CAT活性升高(P＜0.05);與異氟烷組比較，異氟烷+海藻糖組海馬組織MDA含量降低，SOD、GSH-Px、CAT 活性升高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠海馬MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性的變化(±s)

表1 各組小鼠海馬MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性的變化(±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與異氟烷組比較:2)P＜0.05

組別MDA(nmol/mg prot)SOD(U/mg prot)GSH-Px(U/mg prot)CAT(U/mg prot)7.8±0.482.1±7.718.5±2.15.8±0.5異氟烷 12.6±0.81)60.2±6.11)10.1±1.51)3.6±0.21)異氟烷+海藻糖紅 8.2±0.52) 78.8±8.22)17.6±2.52)5.5±0.32)海藻糖紅 4.5±0.31) 95.3±9.41)27.6±3.31)8.6±0.71)正常對(duì)照組

2.5 各組海馬SOD、GSH-Px、CAT的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與正常對(duì)照組比較，異氟烷組海馬SOD、GSH-Px、CAT表達(dá)減少(P＜0.05)，海藻糖組海馬 SOD、GSH-Px、CAT 表達(dá)增加(P＜0.05);與異氟烷組比較，異氟烷+海藻糖組海馬SOD、GSH-Px、CAT表達(dá)增加(P＜0.05)。見(jiàn)圖3～圖5。

圖3 吸入麻醉藥異氟烷和(或)海藻糖對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬SOD活性的影響(免疫組織化學(xué)法，×40)

圖4 吸入麻醉藥異氟烷和(或)海藻糖對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬GSH-Px活性的影響(免疫組織化學(xué)法，×40)

圖5 吸入麻醉藥異氟烷和(或)海藻糖對(duì)轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬CAT活性的影響(免疫組織化學(xué)法，×40)

3 討論

氧化應(yīng)激和自由基損傷與AD發(fā)病密切相關(guān)〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(Aβ)的異常聚集、氧化應(yīng)激的積聚、線粒體的損傷是AD的重要病理因素，它們相互影響，共同促進(jìn)AD病理進(jìn)程的進(jìn)展。線粒體作為細(xì)胞能量的主要來(lái)源，其在氧化磷酸化的同時(shí)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物ROS。蓄積的ROS不僅氧化細(xì)胞內(nèi)的DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)，還能促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集(Aβ蛋白聚集)。Aβ在聚集過(guò)程可以產(chǎn)生ROS，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)〔6〕，而Aβ的聚集還能直接損傷線粒體，生成過(guò)多的 ROS〔7〕。大量的 Aβ、ROS和Ca2+進(jìn)入線粒體，能夠引起線粒體腫脹和膜電位消失，能量生成減少，ROS生成進(jìn)一步增加，最后引起線粒體破裂，細(xì)胞色素C的釋放和凋亡因子的激活，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。MDA是氧自由基氧化生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物，MDA水平能反映出機(jī)體氧化應(yīng)激的程度。SOD、GSH-Px和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶類(lèi)，SOD能清除超氧陰離子自由基，而GSH-Px和CAT能特異性地分解過(guò)氧化氫，SOD、GSH-Px和CAT活性高低反映了機(jī)體清除氧自由基能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)估嚙齒類(lèi)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的重要手段之一，對(duì)海馬結(jié)構(gòu)受損尤其敏感，常用來(lái)評(píng)價(jià)藥物作用效果。本研究顯示，吸入麻醉藥異氟烷不僅能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)APP基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損害，還能明顯加劇海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷。臨床相關(guān)濃度的吸入麻醉藥異氟烷能夠誘導(dǎo)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶損害和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加劇AD神經(jīng)病理進(jìn)程。異氟烷能降低細(xì)胞存活率，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(Caspase-3)活化，ROS積聚，線粒體功能障礙、減少ATP生成〔8〕。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞、神經(jīng)元和正常小鼠腦內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷能增加Aβ的生成，促進(jìn)ROS產(chǎn)生，細(xì)胞色素C的釋放，降低Bcl-2表達(dá)，增加Bax表達(dá)，誘導(dǎo)Caspase-3活化和凋亡〔3〕，上述觀點(diǎn)支持本研究結(jié)果。

海藻糖(C12H22O11)由兩個(gè)葡萄糖分子以 α，α，1，1-糖苷鍵構(gòu)成，是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒性的天然非還原性雙糖，在自然界中廣泛存在于多種植物和非哺乳動(dòng)物體內(nèi)。海藻糖是一種天然的細(xì)胞保護(hù)劑，可以保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗多種有害刺激和損傷(如脫水、氧化應(yīng)激、高溫等)〔4〕，還能保存蛋白質(zhì)藥物、人類(lèi)組織和細(xì)胞活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，海藻糖能改善轉(zhuǎn)基因AD鼠的行為學(xué)缺陷程度，減少腦內(nèi)磷酸化Tau和Aβ聚集〔9〕。體內(nèi)研究顯示，給予海藻糖能夠抑制亨廷頓病轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)多聚谷酰胺的形成，改善運(yùn)動(dòng)功能，并延長(zhǎng)壽命〔10〕。Yang等〔11〕報(bào)道腦內(nèi)移植神經(jīng)干細(xì)胞復(fù)合海藻糖能夠減輕轉(zhuǎn)基因鼠亨廷頓病模型的神經(jīng)病理過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，給予海藻糖治療能夠減輕轉(zhuǎn)APP基因小鼠海馬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激水平，明顯減輕異氟烷誘導(dǎo)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶損害和海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，提示海藻糖治療能夠拮抗吸入麻醉藥異氟烷對(duì)AD的細(xì)胞毒性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，給予抗氧化劑能夠阻止轉(zhuǎn)基因AD鼠的空間記憶功能的喪失，保護(hù)蛋白質(zhì)不受氧化應(yīng)激性損傷，減少腦內(nèi)Aβ聚集〔12〕。很多研究表明海藻糖能夠保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷〔4〕。細(xì)胞內(nèi)海藻糖能夠?qū)够钚匝踝杂苫膿p傷，保護(hù)細(xì)胞和蛋白質(zhì)的活性〔13〕。給予海藻糖能夠明顯增強(qiáng)真菌抵抗 H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷的能力〔14〕。Bleoanca等〔15〕顯示海藻糖還能降低由脂質(zhì)過(guò)氧化損傷介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，上述觀點(diǎn)均支持本研究結(jié)果。

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