王云浩 陳清漢 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，河南 鄭州 450014)

糖尿病性周圍神經(jīng)病在糖尿病(DM)慢性并發(fā)癥中常見，其藥物治療主要為控制血糖、改善神經(jīng)供血、高肌醇飲食、醛糖還原酶抵制劑治療等，常用藥物有:①尿激酶;②蝮蛇抗栓酶;③藻酸雙脂鈉;④醛糖還原酶抑制劑;⑤鈣拮抗劑;⑥谷胱甘肽;⑦神經(jīng)節(jié)苷脂;⑧前列腺素E1膠囊;⑨神經(jīng)生長因子;⑩中草藥等〔1～3〕。本實(shí)驗(yàn)研究鈣拮抗劑、神經(jīng)生長因子(NGF)對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病模型預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的影響，探討其促進(jìn)神經(jīng)再生的機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，質(zhì)量190～210 g，合格證號(hào):SCXK魯20130001，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室供給。

1.2 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司，批號(hào):S01301)、重組鼠 β 神經(jīng)生長因子(β-NGF，美國 Peprotech公司，批號(hào):0307394)、尼莫地平片(Nimodipine，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司批號(hào):120701)。

1.3 造模與分組 60只大鼠，隨機(jī)取12只為空白對(duì)照組(Control)，其余用STZ造模，用0.1 mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.5，4℃)將STZ配成0.45%的溶液，按70 mg/kg的劑量標(biāo)準(zhǔn)給大鼠腹腔注射，72 h后大鼠禁食8 h斷尾取血，測(cè)定血糖大于16.7 mmol/L者為成模，將成模大鼠36只，隨機(jī)分為DM組、DM+NGF組和DM+Nimodipine組。為防止感染，給藥后前2 w腹腔注射青霉素640 000 U/只。

1.4 給藥方法DM+NGF組給予 β-NGF(200 μg·kg-1·d-1)后肢肌肉注射;DM+尼莫地平組給予尼莫地平20 mg·kg-1·d-1，使用時(shí)將尼莫地平用蒸餾水制成混懸液(10 mg/ml)灌胃，DM組分別肌肉注射和灌胃等量的生理鹽水。

1.5 取材 建模成功的大鼠在0、4、8、12 w分別取材，以10%水合氯醛為麻醉劑，按350 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，分離大鼠雙側(cè)肌肉組織，取出兩側(cè)的坐骨神經(jīng)，0.1 mol/L二甲砷酸緩沖液(pH7.4，含8%蔗糖)配制的 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛固定液續(xù)固定1 h(4℃)，緩沖液漂洗2 h。

1.6 酶組織化學(xué) 材料用恒冷箱切片機(jī)(JUNG CM1800)制成冰凍切片厚10 μm，進(jìn)行組化反應(yīng)。AchE酶組織化學(xué):采用Karnovsky Roots法配制孵育液，切片置于孵育液中(37℃，60 min)反應(yīng)后漂洗，甘油明膠封片，鏡檢。坐骨神經(jīng)AchE透光度值正常值92.345 6±0.732 9。

1.7 酶活性觀察及圖像分析定量測(cè)量 使用LUZEX-F計(jì)算機(jī)圖像分析儀(日本)測(cè)AchE酶活性，根據(jù)酶活性反應(yīng)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組標(biāo)本酶反應(yīng)強(qiáng)弱進(jìn)行活性觀察及定量分析。每組隨機(jī)抽取坐骨神經(jīng)切片6張，每張切片3個(gè)視野，測(cè)量表示酶反應(yīng)強(qiáng)弱的透光度值。測(cè)定視野越亮，所測(cè)值越大，表示酶活性越小，反之酶活性越大。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單向方差分析(one-way ANOVA)，Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較，并通過重復(fù)測(cè)量資料的方差分析闡明各組與時(shí)間效應(yīng)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和血糖 DM大鼠在STZ注射后72 h至處死前，血糖明顯增高，并保持相對(duì)穩(wěn)定，在β-NGF和Nimodipine干預(yù)下未見血糖明顯變化。造模后DM大鼠體重增加緩慢，與Control組相比明顯減輕，β-NGF和Nimodipine干預(yù)對(duì)體重變化沒有明顯影響。

2.2 坐骨神經(jīng)AchE活性變化 Control組坐骨神經(jīng)干平行排列的軸突上有棕紅色AChE陽性反應(yīng)產(chǎn)物(亞鐵氰化酮顆粒)，著色軸突粗細(xì)不等，染色深淺也有差別。給藥后4 w，模型組、NGF組和尼莫地平組的AchE活性均下降，軸突排列變紊亂，NGF組活性略高于其他組，差異無顯著性。給藥后8 w，NGF組、尼莫地平組AChE活性有所恢復(fù)，遠(yuǎn)側(cè)段有AChE陽性反應(yīng)軸突出現(xiàn)，NGF組AchE陽性反應(yīng)軸突數(shù)量多于尼莫地平組。模型組未見明顯恢復(fù)。給藥后12 w，NGF組AChE陽性反應(yīng)纖維數(shù)及活動(dòng)基本正常，尼莫地平組AChE陽性反應(yīng)軸突數(shù)量也增多，NGF組強(qiáng)于尼莫地平組。模型組仍未見明顯恢復(fù)，見圖1。

圖1 各組AchE活性(×40)

2.3 坐骨神經(jīng)AchE活性透光度值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果見表1。DM+NGF組在4 w內(nèi)與Control組對(duì)比無顯著性差異(P＞0.05);4 w時(shí)透光度值變大，與Control組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與DM組、DM+Nimodipine組對(duì)比差異無顯著性(P＞0.05);8 w、12 w時(shí)透光度值變小，與DM組、DM+Nimodipine組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DM+Nimodipine組在4 w內(nèi)與Control組對(duì)比無顯著性差異(P＞0.05);4 w時(shí)透光度值變大，與Control組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與DM組、DM+NGF組對(duì)比差異無顯著性(P＞0.05);8 w、12 w時(shí)透光度值變小，與Control組、DM組、DM+NGF組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DM組在4 w內(nèi)與Control組、DM+NGF組、DM+Nimodipine組對(duì)比無顯著性差異(P＞0.05);4 w時(shí)與Control組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與DM+NGF組、DM+Nimodipine組對(duì)比無顯著性差異(P＞0.05);8 w、12 w時(shí)與Control組、DM+NGF組、DM+Nimodipine組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。最后經(jīng)重復(fù)測(cè)量資料的方差分析得:DM+NGF組和DM+Nimodipine組在4 w以后透光度均數(shù)值隨時(shí)間延長而變小(均 P＜0.05)。

表1 坐骨神經(jīng)AchE活性透光度值分析結(jié)果(±s)

表1 坐骨神經(jīng)AchE活性透光度值分析結(jié)果(±s)

與Control組比較:1)P＜0.05;與DM組比較:2)P＜0.05;與DM+NGF組比較:3)P＜0.05

組別 n 0 w 4 w 8 w 12 w Control組 12 95.720 5±0.520 7 94.613 6±0.714 6 94.880 1±0.731 9 94.552 6±0.397 9 DM 組 12 95.766 3±0.031 0 134.545 7±0.796 71) 145.067 2±0.737 21)3) 144.757 4±0.499 51)3)DM+NGF 組 12 95.922 6±0.602 4 125.922 2±0.651 81) 98.193 4±0.524 22) 92.639 2±0.899 02)DM+Nimodipine組 12 95.904 8±0.263 5 129.619 4±0.551 51) 110.669 1±1.042 61)2)3) 97.917 9±0.842 02)3)

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病的發(fā)病機(jī)制目前還不完全清楚，近年普遍認(rèn)為其發(fā)生與多種因素共同作用有關(guān)，包括血管病變、代謝紊亂、NGF減少及遺傳因素、自身免疫功能、血液流變學(xué)改變等等。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道〔4～7〕，NGF在周圍神經(jīng)損傷后，損傷遠(yuǎn)端NGF及其mRNA平均水平增高數(shù)倍，NGF低親和力受體表達(dá)增強(qiáng)，與其他一些與軸突再生的物質(zhì)共同作用使再生軸突成熟及髓鞘化，達(dá)到完全再生和恢復(fù)功能的目的。此外，NGF還有調(diào)節(jié)免疫、造血、內(nèi)分泌等作用非神經(jīng)組織的功能，通過增進(jìn)損傷神經(jīng)元自身修復(fù)能力和提高非神經(jīng)細(xì)胞協(xié)助修復(fù)功能等作用來促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)〔8，9〕。而鈣拮抗劑的使用是糖尿病周圍神經(jīng)病治療學(xué)上的重要進(jìn)展，尼莫地平為最常用的鈣離子拮抗劑尼莫通的主要活性成分，已有大量研究證實(shí)其對(duì)于糖尿病周圍神經(jīng)病治療的確切效果〔10～12〕。作用主要為增加神經(jīng)血流量、改善神經(jīng)缺血缺氧、增加神經(jīng)內(nèi)毛細(xì)血管密度、促進(jìn)微血管生長、減少坐骨神經(jīng)損傷后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡及Bax的表達(dá)，具有直接的神經(jīng)保護(hù)作用。

AchE是一多分子型復(fù)雜蛋白質(zhì)，在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)與乙酰膽堿受體一起參與完成神經(jīng)-神經(jīng)及神經(jīng)-肌肉間動(dòng)作電位的傳遞，是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶。AchE陽性強(qiáng)弱提示膽堿能神經(jīng)元遞質(zhì)-乙酰膽堿含量及其生理功能狀態(tài)。坐骨神經(jīng)中含大量膽堿能神經(jīng)元的有髓神經(jīng)纖維，所以坐骨神經(jīng)損傷后，AchE活性可反映其再生修復(fù)情況。建模成功大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，坐骨神經(jīng)軸突的物質(zhì)運(yùn)輸發(fā)生障礙，軸膜的電生理狀態(tài)發(fā)生改變，逆行性改變使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的代謝發(fā)生變化，其合成AchE的量及向遠(yuǎn)側(cè)運(yùn)輸AchE的能力下降，這樣，坐骨神經(jīng)中AchE的量就有所改變。本文結(jié)果顯示，NGF和尼莫地平對(duì)損傷的坐骨神經(jīng)恢復(fù)起促進(jìn)作用，提示兩者對(duì)坐骨神經(jīng)膽堿能神經(jīng)運(yùn)動(dòng)纖維再生起促進(jìn)作用，也說明兩者對(duì)損傷的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元起保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)作用，其中神經(jīng)生長因子作用優(yōu)于尼莫地平。

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