吳曉光 李 玲 苗光新 趙淑敏 檀榮方 曹 慧

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，河北 承德 067000)

慢性腦供血不足是引起血管性癡呆(VD)最常見的原因之一。腦組織缺血缺氧可引起神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死、凋亡及膠質(zhì)細(xì)胞腫脹增生。乙酰膽堿(Ach)是與學(xué)習(xí)記憶最為密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)〔1〕，海馬組織內(nèi)Ach含量持續(xù)性減少是VD發(fā)生、發(fā)展的主要原因〔2〕。山楂葉總黃酮(TFHL)是從山楂樹葉中提取分離的黃酮化合物〔3〕，主要成分為蘆丁、牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、槲皮素和金絲桃苷等〔4〕。TFHL制劑(益心酮)具有降血壓、降血脂、強(qiáng)心、抗心肌缺血〔5〕、提高腦組織抗氧化〔6，7〕等多方面的作用，在心血管疾病方面療效肯定，臨床已得到廣泛應(yīng)用，但其對VD的學(xué)習(xí)記憶障礙是否具有保護(hù)作用尚不清楚。本研究觀察TFHL對VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)元形態(tài)密度、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)及海馬組織內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 成年雄性清潔級SD大鼠，60只，體質(zhì)量(260±20)g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:scxk(京)2006-2009。飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院二級實(shí)驗(yàn)動物中心，室溫維持在18～24℃，相對濕度(40～60)%，自然光照，自由進(jìn)食進(jìn)水。適應(yīng)1 w，大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ組，每組12 只。

1.2 藥物 TFHL購于山西振東泰盛制藥有限公司，純度98%。用前蒸餾水溶解，濃度為10 mg/ml。

1.3 試劑與儀器 GFAP抗體、3，3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)試劑盒，SABC免疫組化試劑盒(博士德生物科技有限公司)，AChE、ChAT試劑盒(南京建成生物工程有限公司)，Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，分光光度計(jì)(上海京工實(shí)業(yè)有限公司)。

1.4 模型制備及給藥 模型組、TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ組制備VD模型:30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸部正中矢狀切口，鈍性分離皮下組織及筋膜，在頸動脈三角處游離出雙側(cè)頸總動脈，結(jié)扎并切斷雙側(cè)頸總動脈，縫合切口，術(shù)后24 h內(nèi)未蘇醒者剔除，并及時補(bǔ)遺。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外，其余操作同其他各組。大鼠蘇醒后，每只注射1次青霉素預(yù)防感染。術(shù)后第 14天，TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ組分別給 TFHL 70、140、280 mg·kg－1·d－1灌胃，連續(xù)36 d。假手術(shù)組及模型組給予等體積生理鹽水。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn):在造模前第4天將大鼠依次放入Morris水迷宮進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練1次，共計(jì)60 s，不放平臺，不記錄成績。在造模前第3天和第2天，將平臺放入任一象限中央，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，用于檢測大鼠間是否存在學(xué)習(xí)記憶障礙:將大鼠從A、B、C、D 4個入水點(diǎn)面向池壁依次放入水中，觀察在60 s內(nèi)大鼠找到并爬上平臺所用的時間(逃避潛伏期)，若60 s內(nèi)未能找到平臺，則將其引導(dǎo)到平臺并在平臺上停留15 s，潛伏期記為60 s。給藥第30天，再將大鼠依次放入Morris水迷宮進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練1次，共計(jì)60 s，不放平臺，不記錄成績。給藥第31天，開始進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，用于檢測大鼠對空間記憶的獲得能力，每天1次，共6 d。

空間探索實(shí)驗(yàn):用于檢測大鼠對平臺區(qū)域的準(zhǔn)確記憶能力，第6天，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺，由第Ⅱ象限入水點(diǎn)面向池壁放入大鼠，觀察大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺區(qū)域的次數(shù)及平臺象限游泳路程百分比。

1.6 病理學(xué)及免疫組化檢測 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6只，30 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定，取腦組織常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)冠狀切片，每隔3片選取1張切片。常規(guī)HE染色，光鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)及密度，并用MiVnt病理圖形分析系統(tǒng)計(jì)算神經(jīng)元密度及細(xì)胞脫失率。免疫組化法檢測GFAP的表達(dá)，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，光鏡下觀察GFAP的表達(dá)情況，利用MiVnt病理圖形分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.7 海馬組織AChE、ChAT活性檢測 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將每組余下的6只大鼠在冰臺上斷頭取腦，分離出海馬組織，4℃生理鹽水沖洗殘留血液，分析天平稱重，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，組織勻漿器勻漿，按試劑盒說明書測定AChE、ChAT活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行one-wayANOVA方差分析，方差齊用LDS檢驗(yàn)，方差不齊用Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠定位航行能力的變化 各組大鼠逃避潛伏期及尋找平臺游泳路程無顯著差異(P＞0.05)。術(shù)后大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，尋找平臺游泳路程明顯延長(P＜0.01);TFHL各組藥物干預(yù)后，TFHLⅠ組大鼠的逃避潛伏期及尋找平臺游泳路程已明顯縮短(P＜0.05)TFHLⅡ、Ⅲ組優(yōu)于Ⅰ組(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著性差異(P＞0.05)，見圖1，表1。

2.2 各組大鼠空間探索能力的變化 模型組的大鼠在60s內(nèi)穿越平臺區(qū)次數(shù)減少，與假手術(shù)組比較平臺象限游泳路程百分比明顯降低(P＜0.01);TFHL各組藥物干預(yù)后，TFHLⅠ組大鼠穿越平臺區(qū)次數(shù)增多，平臺象限游泳路程百分比顯著增加(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組優(yōu)于Ⅰ組(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著性差異(P＞0.05)，見圖2，表1。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及密度的變化 HE染色顯示，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，可見3～4層細(xì)胞，染色均勻，細(xì)胞核大而圓，染色淺，核仁清晰;模型組大部分神經(jīng)元變性壞死，排列紊亂，細(xì)胞周圍間隙加大，細(xì)胞核濃縮、深染、溶解、消失，細(xì)胞胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，神經(jīng)元密度顯著降低;與模型組比較，TFHL各組病變明顯減輕，正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，排列稍規(guī)則，結(jié)構(gòu)較清晰，神經(jīng)元密度顯著增多(P＜0.05，P＜0.01)，TFHLⅡ、Ⅲ組優(yōu)于Ⅰ組(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠定位航行能力的變化

圖2 各組大鼠空間探索能力的變化

表1 各組大鼠定位航行能力、空間探索能力、CA1區(qū)神經(jīng)元密度及神經(jīng)元脫失率的比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠定位航行能力、空間探索能力、CA1區(qū)神經(jīng)元密度及神經(jīng)元脫失率的比較(±s，n=12)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

組別 逃避潛伏期(s)游泳距離(m) 穿越平臺次數(shù) 平臺象限游泳距離百分比神經(jīng)元密度(mm2)神經(jīng)元脫失率(%)0.5376.43±9.260模型組 19.54±6.121) 3.6502±0.62311) 3.96±1.341) 33.42±5.321) 38.74±8.351) 48.47±6.121)TFHL Ⅰ組 13.43±2.792) 2.3912±0.46822) 5.92±1.982) 43.68±6.142) 46.62±5.482) 17.64±4.382)TFHL Ⅱ組 10.01±2.853) 2.0044±0.32193) 6.17±2.123) 48.22±7.393) 54.93±2.632) 14.67±3.803)TFHL Ⅲ組 9.14±2.943) 1.8302±0.39683) 7.22±2.233) 49.56±7.463) 56.26±6.232) 14.32±3.563)假手術(shù)組 5.86±2.431.1302±0.3614 12.40±4.2669.43±1

圖3 各組大鼠腦組織GFAP表達(dá)的變化(DAB，×400)

2.4 各組大鼠腦組織GFAP的表達(dá)變化 免疫組化染色顯示:假手術(shù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)弱陽性，位于胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞陽性突起較小;模型組表達(dá)數(shù)量增多，胞體腫脹，突起增粗，呈強(qiáng)陽性;TFHL各組藥物干預(yù)后，GFAP表達(dá)明顯減少，胞體腫脹減輕(P＜0.05，P＜0.01)，TFHLⅡ、Ⅲ組優(yōu)于Ⅰ組(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P＞0.05)，見圖3，表2。

2.5 各組大鼠海馬AchE、ChAT活性的變化 分光光度比色法顯示:模型組大鼠海馬組織內(nèi)AchE活性升高，ChAT活性降低，與假手術(shù)組比較有極顯著差異(P＜0.01);TFHL各組藥物干預(yù)后，AchE活性降低，ChAT活性升高，與模型組比較有顯著差異(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組優(yōu)于Ⅰ組(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦組織GFAP表達(dá)、ChAT、AchE活性變化的比較(±s，n=6)

表2 各組大鼠腦組織GFAP表達(dá)、ChAT、AchE活性變化的比較(±s，n=6)

0.14±0.08226.83±39.760.66±0.17模型組 3.46±0.891) 119.84±46.521) 1.32±0.351)TFHL Ⅰ組 1.56±0.562) 155.34±39.612) 0.94±0.282)TFHL Ⅱ組 1.07±0.263) 179.63±38.263) 0.84±0.193)TFHL Ⅲ組 0.93±0.173) 186.53±37.793) 0.82±0.233)GFAP ChAT AchE假手術(shù)組組別

3 討論

VD主要表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知功能缺損，嚴(yán)重影響著患者的身心健康。海馬是參與學(xué)習(xí)記憶功能的主要腦區(qū)，與海馬膽堿能系統(tǒng)密切相關(guān)〔8〕。海馬血供單一，少有側(cè)支循環(huán)，對缺血缺氧極為敏感。有證據(jù)表明，缺血導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元脫失是VD的主要病理基礎(chǔ)〔9〕。本文結(jié)果顯示:TFHL各組藥物干預(yù)后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)恢復(fù)正常，密度增加，學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高，說明TFHL可保護(hù)神經(jīng)元、減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元脫失，改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中數(shù)量龐大的一組非神經(jīng)元細(xì)胞，對神經(jīng)元起支持、保護(hù)、營養(yǎng)作用。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，其表達(dá)量的多少可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在VD的發(fā)生與發(fā)展中起到一定的作用〔10〕。VD病腦內(nèi)存在異常激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞，這些被激活的星形膠細(xì)胞釋放一些毒性因子參與了VD的發(fā)病過程，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，可減輕VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TFHL各組海馬組織內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)明顯減少，胞體腫脹減輕，說明TFHL藥物對腦缺血的保護(hù)作用機(jī)制可能與其抑制腦缺血后GFAP過度活化，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子有關(guān)。

Ach是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在腦組織內(nèi)廣泛分布，與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。ChAT是合成Ach的關(guān)鍵酶，主要存在于膽堿能神經(jīng)元內(nèi)，在胞體內(nèi)合成，通過軸突運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)末梢的胞質(zhì)中，是衡量Ach能神經(jīng)元功能的主要標(biāo)志〔12〕。AChE的作用是分解 Ach，與 ChAT共同調(diào)節(jié) Ach的動態(tài)平衡。研究發(fā)現(xiàn)VD患者腦組織內(nèi)乙酰膽堿含量減少，ChAT的活性降低，膽堿能神經(jīng)的信息傳遞中斷，造成動物獲得性記憶障礙〔13〕。另有實(shí)驗(yàn)表明大鼠腦缺血后，VD含量降低，給予擬膽堿能藥物能增強(qiáng)ChAT的活性，增加腦組織內(nèi)VD含量，改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能〔14〕。本研究結(jié)果說明TFHL可通過降低海馬神經(jīng)元AChE活性、增強(qiáng)ChAT活性來增加腦組織乙酰膽堿含量，從而恢復(fù)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能。

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