李甜甜 呂 霄 李 偉 (徐州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江蘇 徐州 22002)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是一種慢性低度炎癥病變，尤其是白細(xì)胞黏附到視網(wǎng)膜微血管可能是導(dǎo)致DR復(fù)雜病理的最終的共同途徑。細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為重要的因子在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔1〕。大麻素受體(CB)1主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周組織如肝臟、胰腺、視網(wǎng)膜、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等也有表達(dá)，對(duì)外周組織代謝起著重要的作用〔2〕。AM251〔N-(piperidin-1-yl)-5-(4-iodophenyl)-1-(2，3-dichlorophenyl)-4-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamide〕是一種高效的、特異的CB1拮抗藥類似物，在結(jié)構(gòu)上與CB1拮抗劑利莫那班非常接近，但與CB1的親和性更強(qiáng)，具有明顯的中樞性陣痛、抑制食欲等作用。研究發(fā)現(xiàn)〔3〕，AM251可改善糖尿病模型小鼠的視網(wǎng)膜病變、胰島素抵抗、葡萄糖耐量異常和血脂紊亂，但其機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)研究AM251對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1和VEGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠40只〔8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào):SCXK(蘇)2005-0005〕。實(shí)驗(yàn)期間，所有大鼠均單籠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，保持室溫21℃ ～27℃，濕度40% ～70%，氨濃度＜14 mg/m3。12 h光照交替，大鼠自由飲水進(jìn)食，保持墊料干燥，不給予胰島素或其他降糖藥物。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國(guó)Sigma公司(置于－20℃冰箱保存)。AM251購自美國(guó)Cayman公司(粉末狀固體，分子質(zhì)量555.2，純度≥98%，為實(shí)驗(yàn)用藥)，ICAM-1和VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自武漢博士德公司。血糖儀及血糖試紙購自美國(guó)強(qiáng)生公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與分組 SD大鼠40只適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為兩組，正常對(duì)照組10只，糖尿病模型組30只。糖尿病模型組大鼠禁食12 h后，通過腹腔一次性注射STZ 55 mg/kg建立糖尿病大鼠模型，正常組僅注射相同劑量的無菌枸櫞酸緩沖液作為對(duì)照。3 d后通過斷尾取血測(cè)血糖＞16.7 mmol/L即認(rèn)為糖尿病大鼠造模成功。所有大鼠均在屏障系統(tǒng)下飼養(yǎng)，自由飲水，覓食。期間每周測(cè)血糖。3個(gè)月后觀察糖尿病大鼠眼底變化，有明顯視網(wǎng)膜出血及滲出者視為DR造模成功。成模大鼠共18只，隨機(jī)分為DR組9只，AM251干預(yù)組(DR-C組)9只。正常組隨機(jī)分為正常生理鹽水對(duì)照組(NC組)5只，正常AM251干預(yù)組(NC-C組)5只。NC-C組及DR-C組每天予AM251腹腔注射0.5 mg/kg，干預(yù)12 w。NC組及DR組同期給予等量生理鹽水腹腔注射12 w。

1.3.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè) AM251干預(yù)12 w后，在10%水合氯醛麻醉下，心臟取血，采用7150型生化分析儀檢測(cè)大鼠血清空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜VEGF 采用SP三步法，連續(xù)石蠟切片厚度4 μm，石蠟切片脫蠟至水。微波爐中(大火2 min，小火10 min)熱抗原修復(fù);3%過氧化氫37℃孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次，按照免疫組化染色試劑盒的說明進(jìn)行操作。

1.3.4 ELISA檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜VEGF和ICAM-1 顯微鏡下，沿角膜鞏膜緣切開眼球，去除晶體及玻璃體，剪碎視網(wǎng)膜，加入150 μl預(yù)冷的組織裂解液。視網(wǎng)膜在冰浴中超聲粉碎2個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)5 s，4℃ 14000 r/min 離心 15 min，取上清液2 μl使用二喹啉甲酸(BCA)進(jìn)行蛋白定量，另取100 μl上清液按試劑盒說明書檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中ICAM-1與VEGF水平。

1.3.5 Western印跡檢測(cè)視網(wǎng)膜ICAM-1、VEGF表達(dá) 新鮮的視網(wǎng)膜超聲粉碎離心后，測(cè)量蛋白質(zhì)的濃度。將等量的蛋白質(zhì)50 μg置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。應(yīng)用抗體ICAM-11∶200與VEGF 1∶200稀釋，與含有蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜反應(yīng)，蛋白質(zhì)的條帶通過加強(qiáng)的光化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)后，掃描、評(píng)價(jià)和分析，應(yīng)用抗體Actin(Sigma，USA)證實(shí)，等量的蛋白質(zhì)加到SDS-PAGE上。

1.3.6 ELISA測(cè)血清sICAM-1水平 大鼠心臟取血，室溫2 h，待血液凝固血塊收縮后，4000 r/min離心10 min。取上清于干凈的Eppendorf管，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中sICAM-1水平，嚴(yán)格按照使用說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠成模情況及死亡率 30只模型組大鼠腹腔注射STZ后，糖尿病成模30只，糖尿病成模率100%，3個(gè)月后查眼底，有明顯出血及滲出者18只，DR成模率60%，隨機(jī)分為DR組9只，DR-C組9只。正常組隨機(jī)分為NC組5只，正常DR-C組5只。實(shí)驗(yàn)過程中DR組和DR-C組分別死亡2只大鼠，NC組和NC-C組無大鼠死亡。

2.2 一般情況 正常對(duì)照組大鼠每日飲水量少，尿量少，精神良好，反應(yīng)靈敏，動(dòng)作敏捷，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量隨周齡增大而穩(wěn)步增長(zhǎng)。DM造模成功的大鼠均出現(xiàn)多尿、多飲、多食、體重減輕，毛發(fā)枯黃無光澤，精神萎靡，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，符合糖尿病的主要特征。給予AM251后，DR-C組大鼠精神情況、活動(dòng)、毛色、飲食等情況較前有明顯改善。

2.3 各組FBG、體質(zhì)量、SBP及血脂水平比較 NC組與NC-C組相比，F(xiàn)BG無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);DR組和DR-C組相比，F(xiàn)BG無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與NC組和NC-C組相比，DR和DR-C組大鼠FBG升高，體質(zhì)量降低(P＜0.01)。四組大鼠間SBP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。干預(yù)前與干預(yù)12 w末，四組大鼠間 TC、TG、HDL-C、LDL-C均無明顯差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠FBG、SBP、體質(zhì)量的變化(±s)

與NC組比較:1)P＜0.01;與DR組比較:2)P＜0.01

組別 n FBG(mmol/L)SBP(mmHg) 體質(zhì)量(g)NC 組 55.74±0.682) 103±11385.20±30.922)NC-C 組 55.88±1.402) 101±13385.20±17.772)DR 組 923.46±4.931) 110±12228.00±15.271)DR-C 組 924.33±4.311) 118±14235.44±15.471)

表2 各組大鼠血脂水平比較(±s，mmol/L)

50.62±0.101.61±0.180.77±0.140.44±0.03 NC-C 組 50.63±0.091.63±0.310.76±0.160.47±0.04 DR 組 90.79±0.111.80±0.251.02±0.440.51±0.09 DR-C組TG TC LDL-C HDL-C NC組組別 n 90.81±0.121.82±0.230.94±0.190.48±0.07

2.4 視網(wǎng)膜形態(tài)病理變化 NC組及NC-C組視網(wǎng)膜細(xì)胞排列整齊，各層結(jié)構(gòu)清晰完整。與NC組相比，DR組視網(wǎng)膜厚度變薄，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目明顯減少;經(jīng)AM251干預(yù)后，DR-C組與DR組相比，上述表現(xiàn)均明顯改善，但與NC組和NC-C組相比，上述指標(biāo)仍增大。

2.5 免疫組化檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá) NC組(136±8)與NC-C組(134±9)大鼠視網(wǎng)膜組織有少量VEGF表達(dá)，DR組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF表達(dá)明顯增加(205±10，P＜0.01);DR-C組(186±14)較DR組視網(wǎng)膜組織VEGF表達(dá)減弱(P＜0.01)，但較NC組和NC-C組表達(dá)仍高(P＜0.01)。見圖1。

2.6 ELISA檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜VEGF、ICAM-1的表達(dá) NC組大鼠與NC-C組大鼠ICAM-1與VEGF少量表達(dá);與NC組相比，DR組大鼠ICAM-1與VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01);DR-C組較DR組ICAM-1與VEGF表達(dá)減弱(P＜0.01)，但較NC組及NC-C組表達(dá)仍高(P＜0.01)。見表3。

表3 ELISA檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF和ICAM的表達(dá)變化(±s)

表3 ELISA檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF和ICAM的表達(dá)變化(±s)

與NC組比較:1)P＜0.01;與DR組比較:2)P＜0.01

組別 n VEGF(μg/g) ICAM-1(μg/g)0.85±0.123.72±0.51 NC-C 組 50.82±0.173.70±0.48 DR 組 92.44±0.221) 7.98±0.321)DR-C 組 91.42±0.191)2) 4.85±0.221)2)NC組5

2.7 ELISA檢測(cè)大鼠血清sICAM-1的表達(dá) NC組大鼠與NC-C組大鼠血清中 sICAM-1少量表達(dá)，與 NC組〔(225.72±70.7)pg/ml〕及 NC-C 組〔(220.55±56.48)pg/ml〕相比，DR 組大鼠 sICAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)〔(1158.74±243.25)pg/ml，(P＜0.01)〕;DR-C 組〔(447.26±85.62)pg/ml〕較DR 組sICAM-1 表達(dá)減弱(P＜0.01)，但較 NC、NC-C 組表達(dá)仍高(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜VEGF免疫組化染色結(jié)果(×400)

2.8 免疫印跡檢測(cè)VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)的變化 與NC組相比，NC-C組VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)無明顯差異(P＞0.05);DR組與DR-C組VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01);與DR組相比，DR-C組 VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)減少(P＜0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜CB1、VEGF、ICAM-1的表達(dá)情況(免疫印跡)

3 討論

DR的病理特征為視網(wǎng)膜新生血管形成和血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)破壞〔4〕。近年來許多研究認(rèn)為微循環(huán)損害是多因素綜合作用的結(jié)果。早期糖尿病視網(wǎng)膜中白細(xì)胞黏附增加，并與DR微血管損傷在時(shí)間和空間上一致。同時(shí)，ICAM-1及其基因表達(dá)上調(diào)，VEGF可引起DR中的炎癥改變〔5〕。增加視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF可明顯增加白細(xì)胞黏附和血-視網(wǎng)膜屏障的破壞。

白細(xì)胞的黏附與聚集在DR發(fā)病機(jī)制中起著啟動(dòng)和介質(zhì)作用。白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附部分是由黏附分子(AMs)調(diào)節(jié)的。ICAM-1正常情況下呈低水平表達(dá)，內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子α等可促進(jìn)其表達(dá)，ICAM-1在活性內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)是循環(huán)白細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)、停滯，是引起局部組織損傷和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。白細(xì)胞停滯引起微血管無灌注，使視網(wǎng)膜缺血，是促炎癥的重要因素，加重DR。

VEGF參與淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿和嗜酸性粒細(xì)胞穿出血管壁到達(dá)炎癥部位的過程。VEGF是目前所知最強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞選擇性促有絲分裂因子和血管生成因子〔6〕，與DR新生血管的形成緊密相關(guān)。能特異性地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，參與新生血管的形成過程，VEGF一方面促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生;另一方面又使細(xì)胞通透性增強(qiáng)，大分子物質(zhì)如纖維蛋白原等進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)中。形成纖維蛋白凝膠，允許和支持新生血管和基質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)向生長(zhǎng)，引起視網(wǎng)膜新生血管形成和纖維增生，最終導(dǎo)致DR。其次，VEGF上調(diào)視網(wǎng)膜局部ICAM-1的基因表達(dá)增加視網(wǎng)膜血管ICAM-1的mRNA和蛋白質(zhì)水平，從而造成視網(wǎng)膜白細(xì)胞的淤滯和BRB破壞。

本研究結(jié)果提示ICAM-1和VEGF可能參與DR的發(fā)病，AM251降低了ICAM-1和VEGF的表達(dá)，說明AM251可能是通過減少黏附分子表達(dá)，對(duì)抗炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮延緩DR保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。

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3 Baur R，Gertsch J，Sigel E.The cannabinoid CB1 receptor antagonists rimonabant(SR141716)and AM251 directly potentiate GABA(A)receptors〔J〕.Br J Pharmacol，2012;165(8):2479-84.

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