李銀玲, 肖明明, 表貞淑, 侯 慧, 楊 锎, 祝立麗, 景士兵

實(shí)驗(yàn)研究

STAT3和VEGF在皮膚惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

李銀玲, 肖明明, 表貞淑, 侯 慧, 楊 锎, 祝立麗, 景士兵

目的 探討信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用組織芯片免疫組化學(xué)S- P法、免疫印跡法檢測(cè)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在35例皮膚惡性黑色素瘤、30例色素痣組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 在皮膚惡性黑色素瘤組織中,信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)陽(yáng)性率分別為65.7%、60.0%，均明顯高于在色素痣中表達(dá)的陽(yáng)性率(P<0.01)。皮膚惡性黑色素瘤中信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)均與腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)；信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.001)。結(jié)論 信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3可能通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)皮膚惡性黑色素瘤組織中新生血管的形成，與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移呈密切相關(guān)。為皮膚惡性黑色素瘤的靶向性治療提供新思路。

皮膚惡性黑色素瘤; 信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3; 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子; 免疫組化學(xué)

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma, CMM)是一種起源于外胚葉神經(jīng)嵴黑素細(xì)胞的高度惡性的腫瘤。易早期發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，死亡率高，嚴(yán)重影響人類的健康和生存質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)免疫組化法檢測(cè)CMM組織中信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and transcription activators 3， STAT3)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelail growth factor， VEGF)蛋白的表達(dá)情況，探討其與臨床病理特征的關(guān)系及二者之間表達(dá)的關(guān)系。

1 臨床資料

選用我院病理科2005年1月至2014年6月活檢標(biāo)本存檔蠟塊。CMM 35例，男性19例，女性16例，平均年齡(52.50±8.57)歲；色素痣30例，男性15例，女性15例，平均年齡(48.35±9.86)歲。CMM根據(jù)Clerk分級(jí):Ⅰ級(jí)2例、Ⅱ級(jí)5例、Ⅲ級(jí)13例、Ⅳ級(jí)9例、Ⅴ級(jí)6例；根據(jù)有無(wú)轉(zhuǎn)移分3期:Ⅰ期(無(wú)轉(zhuǎn)移)21例、Ⅱ期(伴局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)9例、Ⅲ期(伴遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移)5例。色素痣為對(duì)照組, 其中皮內(nèi)痣15例、復(fù)合痣8例、交界痣7例。所有標(biāo)本均為手術(shù)切除獲得,術(shù)前未經(jīng)放療、化療和其他免疫治療,患者均知情同意。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑 STAT3多抗,VEGF多抗,SABC試劑盒及顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2.2 構(gòu)建組織芯片 組織芯片整齊排列，制成蠟塊，連續(xù)切片常規(guī)作HE染色，切片厚度為5 μm，裱片溫度控制在40 ℃左右，余同常規(guī)制片，用于免疫組織化學(xué)染色的組織片裱于經(jīng)10%APES的丙酮液處理的載玻片上，用紫外線燈烤片以防止掉片或移位。2.3 免疫組織化學(xué)染色 組織芯片常規(guī)脫蠟，切片浸于50 mmol/L EDTA溶液中(pH 8.0)，微波抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫，充分水洗，PBS浸洗，滴加正常山羊血清封閉液，室溫封閉20 min，甩去多余液體，不洗，加入VEGF單抗或STAT3單抗4 ℃過(guò)夜；PBS洗滌；滴加SP 9000通用型生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育20 min，PBS液沖洗2 min，3次；顯色劑顯色；自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明，封片。由正常小鼠血清代替一抗作替代對(duì)照，PBS作空白對(duì)照。2.4 蛋白質(zhì)提取與Western blot鑒定 收集新鮮組織在離心管中，使用NP40裂解液冰上勻漿組織。13 000 g 4 ℃離心30 min，將上清轉(zhuǎn)到新的離心管中，取上清5 μl，選用G250考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白定量后，取40 μg總蛋白經(jīng)10% SDS- PAGE凝膠分離，4 ℃過(guò)夜40 V恒壓轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量，切割PVDF膜，用一抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶5000稀釋)二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影，Image Lab圖像分析軟件測(cè)定灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照記錄各目的蛋白的相對(duì)灰度值。2.5 結(jié)果判斷 STAT3以腫瘤細(xì)胞的胞漿和(或)細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性，VEGF以腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，著色細(xì)胞<5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽(yáng)性(+)，26%～50%為陽(yáng)性()，>50%為強(qiáng)陽(yáng)性()。2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩因素間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析。

3 結(jié)果

STAT3和VEGF在CMM中的陽(yáng)性率為65.7%和60.0%,在色素痣中的陽(yáng)性率為16.7%和3.3%,二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。STAT3在CMM組織中主要在腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)(圖1) ，在色素痣組織中大部分無(wú)表達(dá)(圖2) ；VEGF在CMM組織中主要在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)(圖3)，在色素痣組織中基本無(wú)表達(dá)(圖4)。免疫印跡法(westernblot，WB)檢測(cè)正常皮膚、色素痣、CMM各5例，STAT3和VEGF蛋白在CMM中的表達(dá)明顯強(qiáng)于皮內(nèi)痣及正常皮膚(圖5)。CMM組織中STAT3及VEGF表達(dá)與Clark分級(jí)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05，表1)，二者的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表2)。

4 討論

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs) 家族包括7個(gè)成員：STAT1～4、STAT5a、STAT5b 和STAT6b，STAT3最易發(fā)生結(jié)構(gòu)磷酸化和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[1]。在生理狀態(tài)下，正常細(xì)胞中STAT3 的激活短暫，但在惡性腫瘤細(xì)胞中STAT3 被持續(xù)激活，并促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。研究證實(shí)，在多種人類腫瘤細(xì)胞中，STAT3蛋白高表達(dá)可上調(diào)與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因表達(dá)，如細(xì)胞周期基因的原癌基因(c- myc、pim- 1)、細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl家族、熱休克蛋白、VEGF等，所以STAT3蛋白可能是參與誘發(fā)腫瘤的關(guān)鍵蛋白。

VEGF 是目前已知最重要的促血管生成因子之一， 其廣泛表達(dá)于成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞，但其受體(flt- 1、flk- 1)則僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞,因此是一個(gè)特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的因子，并具有多種生物學(xué)功能： ⑴選擇性增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂,刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成[3]；⑵增強(qiáng)微小血管的滲透性,使血漿大分子外滲沉積在血管外的基質(zhì)中,為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營(yíng)養(yǎng)；⑶抑制抗原呈遞細(xì)胞的成熟，逃避免疫應(yīng)答[4]。VEGF與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，能直接反映腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)移傾向，可作為腫瘤代謝及轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。二者在CMM中表達(dá)較色素痣組強(qiáng), 可推測(cè)在CMM中STAT3和VEGF有促進(jìn)微血管生成的作用。因腫瘤的預(yù)后與組織類型、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等多種情況有關(guān)。研究中STAT3和VEGF在Clark分級(jí)高的和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Clark分級(jí)低的和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說(shuō)明它們與CMM細(xì)胞生長(zhǎng)、局部侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，STAT3和VEGF在體內(nèi)外協(xié)同刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增生和毛細(xì)血管的生成。Wang等[5]研究證明，利用RNA干預(yù)技術(shù)沉默STAT3可以降低VEGF的表達(dá)。Cheong等[6]報(bào)道，異澤蘭黃素可以通過(guò)阻斷胃癌MKN- 45細(xì)胞的STAT3通路而抑制VEGF表達(dá)。本研究也表明,在CMM組織中STAT3和VEGF共陽(yáng)性表達(dá)與共陰性表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明STAT3與VEGF呈正相關(guān)，推測(cè)STAT3和VEGF在促進(jìn)血管形成方面有協(xié)同作用?？赡芘cSTAT3調(diào)控VEGF及其受體的表達(dá)，誘導(dǎo)VEGF的合成有關(guān)。同時(shí)提示了CMM在控制新血管生成治療方法中應(yīng)多因素聯(lián)合應(yīng)用。

圖1 STAT3在CMM中陽(yáng)性表達(dá)(SP ×400) 圖2 STAT3在色素痣中陰性表達(dá)(SP ×100) 圖3 VEGF在CMM中陽(yáng)性表達(dá)(SP ×400) 圖4 VEGF在色素痣中陰性表達(dá)(SP ×100) 圖5 WB法檢測(cè)STAT3、VEGF在正常皮膚組織(1)、色素痣(2)及CMM(3)中蛋白表達(dá)情況

Fig 1 The positive expression of STAT3 protein in CMM (SP ×400). Fig 2 The negative expression of STAT3 protein in nevus (SP ×100). Fig 3 The positive expression of VEGF protein in CMM (SP ×400). Fig 4 The negative expression of VEGF protein in nevus (SP ×100). Fig 5 The expression of STAT3, VEGF protein in normal skin tissue(1), nevus(2) and CMM(3) by WB.

表1 STAT3、VEGF蛋白表達(dá)與CMM臨床病理特征的關(guān)系

Tab 1 Relationship between the expression of STAT3 and VEGF and clinical pathological characteristics of CMM

因素Clark分級(jí)(例,%)Ⅰ級(jí)Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)Ⅳ級(jí)Ⅴ級(jí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(例,%)Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期STAT302(40.0)8(61.5)7(77.8)6(100.0)10(47.6)8(88.9)5(100.0)VEGF1(50.0)2(40.0)6(46.2)6(66.7)6(100.0)9(42.9)7(77.8)5(100.0)

表2 STAT3和VEGF在CMM中的表達(dá)相關(guān)性

STAT3、VEGF可能在CMM發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等方面都發(fā)揮著重要作用。其對(duì)判斷CMM的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，抗血管治療和預(yù)后具有臨床應(yīng)用價(jià)值，可以作為CMM臨床輔助診斷，也可用于評(píng)價(jià)抗血管生成藥物的治療效果。

[1] 王梅平, 陳燕凌, 黃 焱, 等. 白細(xì)胞介素6促膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲與JAK/STAT3信號(hào)通路的關(guān)系[J]. 中國(guó)普通外科雜志, 2013,22(8):982- 987.

[2] 葉立群, 張謝夫, 趙春臨, 等. 結(jié)直腸癌組織STAT3和MMP- 9表達(dá)及其與血管生成相關(guān)性的研究[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2011,18(12):949- 952.

[3] 哈建利, 張澤波. 卵巢癌組織中VEGF的表達(dá)及其與MVD的關(guān)系[J]. 咸寧學(xué)院學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2011,25(4):296- 298.

[4] 楊憲廣, 孫 冀.VEGF研究進(jìn)展及其在喉癌中的相關(guān)研究實(shí)用腫瘤學(xué)雜志[J]. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志, 2011,25(6):575- 578.

[5]WangXH,LiuBR,QuB,etal.SilencingSTAT3mayinhibitcellgrowththroughregulatingsignalingpathway,telomerase,cellcycle,apoptosisandangiogenesisinhepatocellularcareinoma：potentialusesforgenetherapy[J].Neoplasma, 2011,58(2):158- 171.

[6]CheongJH,HongSY,ZhengY,etal.EupatilininhibitsgastriccancercellgrowthbyblockingSTAT3-mediatedVEGFexpression[J].JGastricCancer, 2011,11(1):16- 22．

Expression of signal transducers and transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor in cutaneous malignant melanoma and its clinical significance

LIYin-ling,XIAOMing-ming,BIAOZhen-shu,etal.

(DepartmentofDermatology,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

Objective To explore the expression of signal transducers- transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor in cutaneous malignant melanoma and its clinical significance. Methods The expression of signal transducers- transcription activators 3 and vascular endothelial growth factor were examined in 35 cases of cutaneous malignant melanoma and 30 cases of nevus by immunohistochemistry and Western blot. Results The positive rates of signal transducers- transcription activators 3 and were 65.7% and 60.0% in the cutaneous malignant melanoma, which were significantly higher than those which were 15.4% and 3.3% in the nevus (P<0.01).Boththeexpressionofsignaltransducers-transcriptionactivators3andvascularendothelialgrowthfactorweresignificantlycorrelatedtogrowthoftumorcell,depthoftumorinvasionandtumorlymphnodemetastasis(P<0.05).Moreover,asignificantcorrelationwasfoundbetweentheexpressionofsignaltransducers-transcriptionactivators3andvascularendothelialgrowthfactorincutaneousmalignantmelanoma(P<0.001). Conclusion The signal transducers- transcription activators 3 may promote the formation of new blood vessels in the CMM by up- regulating the expression of vascular endothelial growth factor which was closely correlated to the tumor growth, invasion and metastasis．This study will provide new way for the targeted treatment of cutaneous malignant melanoma.

Cutaneous malignant melanoma; Signal transducers and transcription activators 3; Vascular endothelial growth factor; Immunohistochemistry

110016 遼寧 沈陽(yáng)，遼寧省人民醫(yī)院 (皮膚科:李銀玲, 表貞淑, 楊 锎, 祝立麗;病理科:肖明明, 侯 慧, 景士兵)

李銀玲(1978- )，女，遼寧沈陽(yáng)人，主治醫(yī)師，碩士研究生. 通信作者：景士兵，110016，遼寧省人民醫(yī)院 病理科，電子信箱：mypathology@163.com

10.3969/j.issn.1673- 7040.2015.03.023

R

A

1673- 7040(2015)03- 0190- 03

2014- 12- 19)