林常敏, 蔡湘娜, 蔡博治, 李 宇, 黃 鏗

實(shí)驗(yàn)研究

人毛乳頭細(xì)胞微囊誘導(dǎo)大鼠足墊毛囊形成模型的建立

林常敏, 蔡湘娜, 蔡博治, 李 宇, 黃 鏗

目的 建立可靠的、異種毛乳頭誘導(dǎo)毛發(fā)形成的動(dòng)物模型。方法 以局部注射方式將毛乳頭細(xì)胞微囊移植至大鼠足墊。移植后第2周至10個(gè)月期間定期取材，觀(guān)察毛囊結(jié)構(gòu)形成的過(guò)程，免疫組化追蹤毛囊形成過(guò)程K15(Keratin15,角蛋白15)的時(shí)空變化。結(jié)果 移植后第10周，移植部位皮膚出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的毛發(fā)纖維。表皮干細(xì)胞標(biāo)記物K15免疫組化染色顯示，處于毛乳頭細(xì)胞微囊上方的表皮干細(xì)胞逐漸向皮下組織遷移。結(jié)論 本研究完全排除了受體動(dòng)物自身毛囊細(xì)胞的干擾，為研究毛囊發(fā)育過(guò)程中上皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞間相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了理想的動(dòng)物模型。

毛囊； 毛乳頭； 誘導(dǎo)； 動(dòng)物模型； 足墊

在毛囊重建、毛發(fā)再生及毛囊生物學(xué)相關(guān)研究中，建立合適的毛發(fā)誘導(dǎo)動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)成功的前提。自20世紀(jì)70年代，以大鼠、小鼠、裸鼠作為受體的毛發(fā)誘導(dǎo)模型相繼建立[1- 4]。然而，目前毛發(fā)誘導(dǎo)模型尚存在以下問(wèn)題：⑴上述實(shí)驗(yàn)所用模型大部分為有毛囊結(jié)構(gòu)的鼠耳或存在退化毛囊結(jié)構(gòu)的裸鼠，無(wú)法排除移植部位自身殘存的毛囊結(jié)構(gòu)的影響；⑵缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范，包括誘導(dǎo)的部位、深度、范圍等，影響了誘導(dǎo)結(jié)果的可信度及穩(wěn)定性[5- 6]。自2008年1月至2013年1月，我們選用大鼠足墊(先天無(wú)毛區(qū))為研究對(duì)象，以排除動(dòng)物受體自身毛囊細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾；并在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上，將相同來(lái)源、相同數(shù)量的人頭皮毛乳頭細(xì)胞APA微囊移植至大鼠足墊皮下，誘導(dǎo)局部毛囊重建和毛發(fā)再生，同時(shí)規(guī)范了微囊移植的部位、層次、范圍，擬進(jìn)一步改良構(gòu)建一個(gè)可靠而穩(wěn)定的人頭皮毛乳頭細(xì)胞,誘導(dǎo)大鼠足墊毛囊結(jié)構(gòu)形成模型。同時(shí)，追蹤基底層表皮干細(xì)胞標(biāo)記物在毛囊再生過(guò)程中的走向，以期獲得表皮干細(xì)胞存在向毛囊上皮細(xì)胞分化潛能的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 人頭皮毛乳頭細(xì)胞微囊誘導(dǎo)大鼠足墊毛囊形成模型的構(gòu)建 人頭皮毛乳頭的分離和培養(yǎng)采用本課題組建立的“改良一步酶消化法”并加以改進(jìn)[7]。毛乳頭細(xì)胞微囊化參照Lin和Sun的方法并進(jìn)行改良[8]。取體外培養(yǎng)了3 d的毛乳頭細(xì)胞微囊進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)。移植前，以無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞微囊1 d；用1 ml注射器抽適量的毛乳頭細(xì)胞微囊，排空培養(yǎng)液，換16號(hào)針頭,自足趾、足掌交界處中點(diǎn)進(jìn)針至足后跟的皮下組織淺層(注意控制進(jìn)針深度)約2.0 mm處，邊退針邊將0.3 ml的人頭皮毛乳頭細(xì)胞微囊注入，范圍2.0 mm×8.0 mm～2.0 mm×10.0 mm，以EC生物膠封閉進(jìn)針口；對(duì)側(cè)足墊注入等體積人成纖維細(xì)胞微囊作為陰性對(duì)照組。術(shù)后2～8周,每周取材1次，以后第10、12、16、20、28、32、40周取材，組織石蠟包埋、切片，觀(guān)察足墊皮膚組織形態(tài)的變化。1.2 石蠟切片的制備 大鼠處死后立即沿足墊邊緣剪下整個(gè)足墊皮膚及皮下組織，沿橫軸修成4小塊，分別轉(zhuǎn)入包埋盒，4%中性多聚甲醛室溫固定4 h；常規(guī)脫水、透明、包埋、切片、HE染色或免疫組化染色。

1.3 蘇丹Ⅲ染色 取移植后第10周肉眼毛發(fā)纖維形成部位的足墊皮膚進(jìn)行冰凍切片；70%乙醇固定1 min；蘇丹Ⅲ乙醇溶液浸染30 min；70%乙醇洗去多余的染料、水化、復(fù)染、固定、觀(guān)察拍照。

1.4 K15免疫組織化學(xué)染色 K15 濃度1∶100，常規(guī)程序進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 毛乳頭細(xì)胞APA微囊的形態(tài) 微囊肉眼呈透明、圓形微粒；相差顯微鏡下觀(guān)察：毛乳頭細(xì)胞微囊呈圓形，直徑400～500 μm，大小均勻，表面光滑，囊中細(xì)胞分布均勻，部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，形似毛乳頭(圖1)。

2.2 人頭皮毛乳頭細(xì)胞微囊誘導(dǎo)大鼠足墊毛囊結(jié)構(gòu)形成模型的建立 肉眼觀(guān)察可見(jiàn)毛乳頭細(xì)胞微囊移植后10～12周，在足墊后側(cè)2/3處(足弓部)接近微囊注射區(qū)周?chē)?、足墊與足背交界0.5 mm左右的無(wú)毛區(qū)觀(guān)察到異常的毛發(fā)纖維，足墊內(nèi)、外側(cè)均有，毛發(fā)2～4根為1撮，長(zhǎng)度3.0～4.0 mm，直徑較粗，性狀接近毛乳頭來(lái)源的人毛發(fā)，無(wú)色，生長(zhǎng)方向與足背毛發(fā)纖維的方向相反(圖2)。毛發(fā)纖維維持4周左右脫落，并觀(guān)察至40周，未再次觀(guān)察到毛發(fā)纖維產(chǎn)生。HE染色觀(guān)察結(jié)果見(jiàn)表1，圖3。

2.3 K15免疫組化染色結(jié)果 K15為表皮干細(xì)胞、尤其是毛囊干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，大鼠足墊毛囊誘導(dǎo)模型K15染色結(jié)果顯示：表皮基底層部分細(xì)胞、微囊周?chē)?、真皮層部分雜亂的細(xì)胞及誘導(dǎo)形成的毛囊毛球部周?chē)捎^(guān)察到K15的表達(dá)，以真皮層新生毛囊結(jié)構(gòu)表達(dá)最強(qiáng)(圖4,5)。

3 討論

毛乳頭誘導(dǎo)毛囊結(jié)構(gòu)重建的功能已被大量的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，但實(shí)驗(yàn)所用模型大部分為有毛囊結(jié)構(gòu)的鼠耳或存在退化毛囊結(jié)構(gòu)的裸鼠。1992年，CA Jahoda等將大鼠足墊皮膚游離后形成表皮- 毛乳頭細(xì)胞凝膠- 真皮的復(fù)合體移植至裸鼠背部，形成了毛囊結(jié)構(gòu)，但由于足墊皮膚的完整結(jié)構(gòu)受到破壞，加上移植復(fù)合體的體積很小(3 mm×4 mm)，依然無(wú)法排除移植部位自身殘存毛囊結(jié)構(gòu)的影響。因此，相關(guān)的研究，包括毛乳頭誘導(dǎo)毛囊再生的分子機(jī)制、毛囊再生過(guò)程相關(guān)信號(hào)通路的相互作用機(jī)制等都受到動(dòng)物模型的制約[9- 12]。

本實(shí)驗(yàn)將選擇大鼠足墊這個(gè)先天毛囊缺如的部位，直接進(jìn)行注射制備動(dòng)物模型，既保持了足墊皮膚的完整性，又充分排除了來(lái)自移植體、受體自身的影響。10周后，在移植部位及其周?chē)纬扇庋劭梢?jiàn)的毛發(fā)纖維，組織切片上還觀(guān)察到毛囊的性狀與其細(xì)胞來(lái)源的人毛囊結(jié)構(gòu)相似，并存在成熟的皮脂腺結(jié)構(gòu)。該動(dòng)物模型的建立，為進(jìn)一步研究毛囊再生啟動(dòng)過(guò)程中相關(guān)信號(hào)分子的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。再則，利用大鼠足墊這個(gè)特殊部位誘導(dǎo)毛囊結(jié)構(gòu)的重建，可以觀(guān)察毛囊從啟動(dòng)發(fā)育- 不成熟結(jié)構(gòu)- 形成成熟結(jié)構(gòu)的完整過(guò)程，與毛囊的胚胎發(fā)生非常相似，對(duì)于研究毛囊發(fā)生的啟動(dòng)機(jī)制，揭開(kāi)第一真皮信號(hào)、第一表皮信號(hào)及毛囊啟動(dòng)過(guò)程表皮- 真皮的相互作用有重要的意義。大鼠足墊移植部位組織學(xué)研究顯示，實(shí)驗(yàn)組足墊皮膚形成的毛囊數(shù)量(30～40個(gè))多于所植入“人工毛乳頭”( 15～20個(gè))的數(shù)量，這一發(fā)現(xiàn)與我們的“人工毛乳頭”鼠耳皮下移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明 “人工毛乳頭”誘導(dǎo)毛囊形成的機(jī)制十分復(fù)雜，它既可以通過(guò)某些信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)啟動(dòng)真皮與上皮間相互作用而形成毛囊，也可能直接參與毛囊結(jié)構(gòu)的組織構(gòu)成。R Michel等研究了表皮細(xì)胞中K19的表達(dá)，K19表達(dá)細(xì)胞在表皮中所占數(shù)量較少，且大部分位于毛囊外根鞘隆突部，以氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷酸標(biāo)記K19細(xì)胞證明其為慢循環(huán)細(xì)胞，這些特征均符合傳統(tǒng)對(duì)表皮干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)[13- 14]。因此，K19可作為表皮干細(xì)胞的一個(gè)表面標(biāo)記。此外，考慮到有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛囊隆突部表皮干細(xì)胞表達(dá)K15(keratin 15，角蛋白15)，而且在干細(xì)胞的分化過(guò)程中，K15表達(dá)的減少較K19表達(dá)的減少更早；K15陰性而K19陽(yáng)性的細(xì)胞可能是“早期”短暫擴(kuò)增細(xì)胞，故在鑒別表皮干細(xì)胞時(shí)K15可能較K19更有意義。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇K15作為追蹤基底層表皮干細(xì)胞遷移的標(biāo)記[15]。本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到，位于毛乳頭細(xì)胞微囊移植部位之上的表皮干細(xì)胞逐漸地向皮下組織遷移，并在毛乳頭細(xì)胞微囊及其周?chē)奂?圖6)。初步證實(shí)在毛乳頭細(xì)胞產(chǎn)生的誘導(dǎo)信號(hào)影響下，表皮干細(xì)胞存在兩個(gè)分化方向，即向上分化為表皮細(xì)胞，向下分化為毛囊上皮細(xì)胞。但是，在這個(gè)過(guò)程中，表皮干細(xì)胞是直接轉(zhuǎn)化為毛囊上皮細(xì)胞，或是首先轉(zhuǎn)化為類(lèi)毛囊干細(xì)胞，再進(jìn)一步分化成毛囊的各種上皮細(xì)胞，尚待進(jìn)一步研究。

圖1 倒置相差顯微鏡下的毛乳頭細(xì)胞微囊(左：×40，右：×100) 圖2 毛乳頭細(xì)胞微囊移植后10～12 周(箭頭所示) 圖3 毛乳頭細(xì)胞微囊誘導(dǎo)大鼠足墊形成毛囊縱切面(HE ×200) a.移植后第3周 b.在微囊周?chē)奂纬擅摇⑵ぶ贅咏Y(jié)構(gòu) c.移植后第4周 d.移植后第8周 e.移植后足中第10周 f.移植后足跟第10周 圖4 毛乳頭細(xì)胞微囊大鼠足墊移植后第10周(左：×200，右：×400 ) 圖5 人毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠足墊新生毛囊形成時(shí)K15呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(×200) a.HE染色 b.K15免疫熒光染色 c.相應(yīng)的DAPI染色顯示的細(xì)胞核結(jié)構(gòu) 圖6 毛乳頭細(xì)胞微囊誘導(dǎo)大鼠足墊形成過(guò)程上皮細(xì)胞的遷移 a.K15熒光免疫組化染色見(jiàn)皮下組織中微囊周?chē)奂罅縆15陽(yáng)性細(xì)胞(左)，DAPI染色顯示核結(jié)構(gòu)(右) b.K15熒光免疫組化染色見(jiàn)表皮干細(xì)胞向下遷移(左)，DAPI染色顯示核結(jié)構(gòu)(右) c.K15熒光免疫組化染色見(jiàn)表皮干細(xì)胞遷移正在形成毛囊樣結(jié)構(gòu)(左，箭頭示表皮基底層，橢圓形框中為正在形成的毛囊樣結(jié)構(gòu))，DAPI染色顯示核結(jié)構(gòu)(右)

Fig 1 Microcapsule structures were access with inverted contrast microscope (left: ×40, right:×100). Fig 2 The tenth to the twelfth week after DPCs microcapsules transplantation (the arrows indicated). Fig 3 Longitudinal sections of hair follicles induced by DPC microcapsules (HE×200). a. the third week after transplantation. b. Hair follicles and sebaceous glands were found around the DPC microcapsules. c. the fourth week after transplantation. d. the eighth weeks after transplantation. e. the tenth week after middle site transplantation. f. the tenth week after heel transplantation. Fig 4 DPC microcapsules transplanted into footpads at the tenth week (left: ×200, right: ×400). Fig 5 K15 was strongly expressed at the regenerated hair follicles induced by DPC microcapsules in the footpads. (×200). a. HE staining. b. K15 fluorescent immunohistochemisry staining. c. DAPI showed the nuclei. Fig 6 Epithelial cells migrated from epidermis to dermis after DPC micrcapsultes transplantation. a. K15 fluorescent immunohistochemical showed positive cells gathered around the DPC microcasultes (left, ×100), DAPI showed nuclei (right, ×100). b. K15 fluorescent immunohistochemical showed epithelial stem cells migration (left, ×200), DAPI showed nuclei (right, ×200). c. K15 fluorescent immunohistochemical showed epithelial stem cells migrating and forming hair follicle structures (left, arrow point out the basal layer, hair follicle structure forming within the oval field, ×200), DAPI showed nuclei (right,×200).

表1 人頭皮毛乳頭細(xì)胞微囊誘導(dǎo)大鼠足墊毛囊結(jié)構(gòu)形成的過(guò)程

本研究建立了一個(gè)異體、異種毛乳頭細(xì)胞移植誘導(dǎo)毛發(fā)形成的動(dòng)物模型，同時(shí)用表皮干細(xì)胞標(biāo)記物的時(shí)空表達(dá)方式初步解釋了該模型毛囊干細(xì)胞的來(lái)源，第一次提出表皮干細(xì)胞的遷移是毛乳頭誘導(dǎo)毛囊形成過(guò)程毛囊細(xì)胞來(lái)源的假說(shuō)，并提供了形態(tài)學(xué)的直接證據(jù)。以大鼠足墊為毛囊結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)模型，完全排除了受體動(dòng)物自身毛囊細(xì)胞的干擾，為研究毛囊發(fā)育過(guò)程中上皮細(xì)胞與真皮細(xì)胞間相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制、利用相關(guān)信號(hào)分子開(kāi)發(fā)促進(jìn)毛囊再生的藥物，提供了理想的動(dòng)物模型，具有重要的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] Ohyama M, Zheng Y, Paus R, et al. The mesenchymal component of hair follicle neogenesis: background, methods and molecular characterization [J]. Exp Dermatol, 2010,19(2):89- 99.

[2] 李 曄, 包 旭, 陳 曦, 等. 小鼠毛囊再生與胸腺素β4的促進(jìn)效應(yīng)[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2014,18(11):1687- 1693.

[3] Chermnykh ES, Vorotelyak EA, Gnedeva KY, et al. Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture[J]. Histochem Cell Biol, 2010,133(5):567- 576.

[4] Lo AT, Mori H, Mott J, et al. Constructing Three- Dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation[J]. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2012,17(2):103- 110.

[5] 戚益銘, 褚 蘊(yùn), 胡林鋒. 體外培養(yǎng)基對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖影響的研究[J]. 求醫(yī)問(wèn)藥(學(xué)術(shù)版), 2012,10 (10):681.

[6] 劉燕茹, 王 琴, 成蓓蓓, 等. 海藻多聚糖硫酸酯對(duì)人毛乳頭細(xì)胞增殖的影響[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué), 2012,21 (11):1542- 1543.

[7] 陳先才, 陳海濱, 蔡博治, 等. 膠原酶消化法分離、培養(yǎng)大鼠觸須毛乳頭的方法[J]. 現(xiàn)代醫(yī)院, 2011,11(5):20- 21.

[8] Lim F, Sun AM. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas[J]. Science, 1980,210(4472):908- 910.

[9] Soma T, Fujiwara S, Shirakata Y, et al. Hair- inducing ability of human dermal papilla cells cultured under Wnt/β- catenin signalling activation[J]. Exp Dermatol, 2012,21(4):307- 309.

[10] Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstructing the Differentiation Niche of Embryonic Stem Cells Using Biomaterials[J]. Macromol Biosci, 2011,11(1):36- 49.

[11] Jaks V, Kasper M, Toftg?rd R. The hair follicle- a stem cell zoo[J]. Exp Cell Res, 2010,316(8):1422- 1428.

[12] Fang DR, Lv ZF, Qiao G. Dynamic Wnt5a expression in murine hair follicle cycle and its inhibitory effects on follicular in vivo[J]. Asian Pac J Trop Med, 2014,7(4):285- 288.

[13] Rabbani P, Takeo M, Chou W, et al. Coordinated Activation of Wnt in Epithelial and Melanocyte Stem Cells Initiates Pigmented Hair Regeneration[J]. Cell, 2011,145(6):941- 955.

[14] Charruyer A, Ghadially R. What′s new in dermatology:epidermalstem cells[J]. G Ital Dermatol Venerel, 2011,146(1):57- 67.

[15] 楊 青, 李秀蘭, 張 楊, 等. 表皮干細(xì)胞與毛囊干細(xì)胞生物學(xué)特性比較[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2012,16(27):5034- 5048.

Model of hair follicle regeneration model induced by microencapsulated dermal papilla cells

LINChang-min,CAIXiang-na,CAIBo-zhi,etal.

(DepartmentofEmergency,SecondAffiliatedHospital,ShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China)

Objective To create a stable animal model for the xenotransplantation of human dermal papilla cells microcapsules into rat footpad to induce the hair follicles formation and growth. Methods Cultured dermal papilla cells were encapsulated and then implanted into the rat footpads. After the xenotransplantation, observed them timely and studied the histomorphology by microscopy from the second week to the tenth month. K15 immunohistochemistry stain and analyzed the relationship between them. Results At the tenth week following transplantation, hair fibers were visible in the footpad. K15 positive cells were transmitting from basal layer to subcutaneous and observed near the dermal papilla cell microcapsules. Conclusion dermal papilla cell microcapsules retain the capacity to initiate follicle regeneration and suitable for allograft or xenotransplatation. The animal model of dermal papilla cells microcapsule induces hair follicles regeneration in rat footpad exclude the effect of hair follicle epithelial cells. It is a stable model for study the interaction of epidermis and dermis during the formation of hair follicle.

Hair follicle; Dermal papilla; Induce; Animal model; Footpad

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81372084，81171832)

515041 廣東 汕頭，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室(林常敏)；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 (美容整形外科：蔡湘娜,李 宇；組織工程實(shí)驗(yàn)室：蔡博治)；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 急診外科(黃 鏗)

林常敏(1978- )，女，廣東汕頭人，副教授，博士.

黃 鏗，515041，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 急診外科，電子信箱：cocolin@stu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673- 7040.2015.03.022

R- 332

A

1673- 7040(2015)03- 0186- 04

2014- 02- 08)