徐烈雨，廉建坡，陳東寧，祝 宇，趙菊平，吳瑜璇，沈周俊，寧 光

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院：1．泌尿外科；2．內(nèi)分泌科 上海 200025）

腎上腺皮質(zhì)癌惡性程度高，病程進(jìn)展迅速，早期診斷較困難；目前針對腎上腺皮質(zhì)癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，尤其對于進(jìn)展期暫時缺乏有效的治療手段。表皮生長因子受體（epiderminal growth factor receptor，EGFR）是一種跨膜糖蛋白，主要由膜外配體結(jié)合區(qū)、單鏈跨膜區(qū)及高度保守的膜內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)組成；其相關(guān)信號通路涉及細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡等多方面。已有的研究表明在腎上腺皮質(zhì)癌腫瘤中EGFR呈過表達(dá)，同時EGFR高表達(dá)也提示皮質(zhì)癌腫瘤的惡性分型以及預(yù)后不良［1－2］；體外實驗也驗證抑制EGFR信號通路后能促進(jìn)ACC細(xì)胞系凋亡，起到一定程度的抑制作用。

埃羅替尼（Erlotinib）是一類EGFR小分子抑制劑；其對腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞尚不明確。本文將重點(diǎn)觀察埃羅替尼對腎上腺皮質(zhì)癌SW13細(xì)胞系信號通路、增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要材料①細(xì)胞：人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW13購自上海中科院細(xì)胞庫；②藥物：埃羅替尼購自美國Selleck公司；③試劑：ERK、mTOR、p－ERK、p－mTOR抗體（CST公司，美國），DMEM 高糖培養(yǎng)基及新生肽牛血清（Gibco公司，美國），碘化丙叮（PI）、四甲基偶氮唑（MTT）、DMSO（Sigma公司，美國）；④儀器：流式細(xì)胞儀 LSRII（BD Bioscience），各種規(guī)格培養(yǎng)皿（Corning Costar，美國）。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)SW13細(xì)胞系接種于96孔板（MTT）或者6cm培養(yǎng)皿（流式細(xì)胞儀和蛋白檢測），DMEM基質(zhì)，10%胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)）以及1%的雙抗，37℃、5%CO2恒溫孵箱常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%左右用于MTT或者流式試驗。

1．3 MTT法檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期SW13細(xì)胞以6．0×103／孔密度接種于96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別于加相應(yīng)濃度藥物（1、2．5、5、10、25、50、125μmol／L）后12、24、48、72h后測定細(xì)胞活力，加入200μL／孔10%MTT，避光37℃恒溫孵箱培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)基中 MTT，然后加入100μL／孔DMSO，室溫?fù)u床放置10min，與酶標(biāo)儀測定各孔吸光值（570nm），繪制細(xì)胞生長曲線。實驗重復(fù)3次，按下述公式計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）＝（實驗組A－空白組 A）／（陰性組 A－空白組 A）×100%。

1．4 細(xì)胞凋亡檢測 將處于對數(shù)生長期的SW13細(xì)胞以3．5×105／孔密度接種于6孔板，加入相應(yīng)濃度藥物（5、20μmol／L）后24h收集細(xì)胞，用無 EDTA的胰酶處理消化SW13細(xì)胞系，14 000r／min×5min離心后去上清，加入Binding緩沖液60μL／孔重懸，制成單細(xì)胞懸液；加入3．8μL FITC－AnnexinV混勻靜置10min，再加入3．8μL PI混勻后室溫避光反應(yīng)10min。上機(jī)前每孔各加入Binding緩沖液120μL，混勻與流式細(xì)胞儀上機(jī)，檢測細(xì)胞凋亡情況；重復(fù)3次實驗。

1．5 細(xì)胞周期測定將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以3．5×105／孔密度接種于6孔板，加入相應(yīng)濃度藥物后24h收集細(xì)胞，按照周期試劑盒測定標(biāo)準(zhǔn)流程操作，使用BD流式細(xì)胞儀分析軟件，重復(fù)3次實驗。

1．6 蛋白檢測收集相應(yīng)濃度藥物處理的SW13細(xì)胞，分別加入 RIPA、Cocktail、PMSF（體積比100∶10∶1），冰上裂解30min，后4℃12 000r／min離心30min，收集上清液后于酶標(biāo)儀BCA定量后以4×Loading液99℃煮沸5min，于－20℃保存。取蛋白于10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，100V恒壓轉(zhuǎn)膜120min后以3%BSA封閉1h后，一抗（3%BSA稀釋1∶1 000）4℃孵育過夜；PBST洗滌三次后與相應(yīng)種屬二抗（3%BSA稀釋1∶10 000）孵育1 h后機(jī)器顯影，每次實驗重復(fù)3次。

1．7 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計分析軟件，結(jié)果以±s表示，使用配對t檢驗來分析兩群細(xì)胞之間的差異，P＜0．05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以Graphpad Prism 5．0軟件作圖。

2 結(jié) 果

2．1 埃羅替尼呈濃度－時間相關(guān)地抑制SW13細(xì)胞增殖通過MTT實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)12、24、48、72 h后，1～125μmol／L濃度的埃羅替尼分別可以抑制SW13細(xì)胞增殖，各組與12h處理組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。其中，作用24h時，1μmol／L埃羅替尼約抑制20%左右的SW13活力，當(dāng)濃度增加到25 μmol／L時，抑制率可達(dá)50%，提示埃羅替尼可以呈劑量相關(guān)地抑制細(xì)胞增殖；同樣，當(dāng)25μmol／L埃羅替尼處理12h時，其抑制率約為45%，但當(dāng)作用時間增加到48h時，抑制率可達(dá)70%，進(jìn)一步證實埃羅替尼抑制增殖效率與時間相關(guān) （圖1）。

圖1 通過MTT實驗檢測一定濃度和時間的埃羅替尼可以抑制SW13細(xì)胞增殖24、48、72h與12h結(jié)果比較，＊＊P＜0．01

2．2 埃羅替尼可以誘導(dǎo)SW13細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，處理24h后，空白組、5μmol／L組、20μmol／L埃羅替尼處理組早期凋亡率（AnnexinV＋／PI－）分別為（1．62±0．21）%、（3．35±0．46）%及（13．49±0．48）%，與空白組對比，分別增加約2倍及8．5倍，提示有效治療濃度的埃羅替尼可以誘導(dǎo)SW13細(xì)胞凋亡；而晚期凋亡率（AnnexinV＋／PI＋）三組分別為（0．98±0．14）%、（0．71±0．11）%、（4．80±0．58）%，提示高濃度埃羅替尼可以促進(jìn)細(xì)胞壞死凋亡（圖2，表1）。

圖2 通過AnnexinV－PI流式檢測埃羅替尼可以誘導(dǎo)SW13細(xì)胞凋亡

表1 埃羅替尼誘導(dǎo)SW13細(xì)胞凋亡

2．3 埃羅替尼對SW13細(xì)胞周期無影響通過PI細(xì)胞周期實驗顯示，空白組、5μmol／L組、20μmol／L埃羅替尼組處理24h后，細(xì)胞周期無明顯改變，G1期均約為70%左右，而G2期則為25% 左右，S期為5%～7%左右，統(tǒng)計學(xué)無差異（圖3），提示埃羅替尼對SW13細(xì)胞周期無明顯影響。

圖3 埃羅替尼對SW13細(xì)胞周期無影響

2．4 埃羅替尼對EGFR下游信號通路蛋白表達(dá)的影響，抑制p－ERK蛋白表達(dá)水平，不影響p－mTOR通過Western blot檢測EGFR下游信號通路蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)空白組、5μmol／L組、20μmol／L埃羅替尼組處理24h后埃羅替尼能夠顯著降低ERK磷酸化表達(dá)水平，并呈劑量相關(guān)性；而同樣，另一條EGFR下游通路mTOR通路則無明顯改變 （圖4）；提示埃羅替尼主要通過ERK通路影響細(xì)胞增殖及凋亡。

圖4 埃羅替尼影響EGFR下游mTOR及ERK通路水平

3 討 論

腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）是起源于腎上腺組織的惡性腫瘤，發(fā)病率低，病死率高［3］；ACC的臨床診斷主要依靠影像學(xué)及內(nèi)分泌檢查，確診則需依靠病理檢查，總體看來腎上腺皮質(zhì)癌治療預(yù)后不佳。目前尚無有效的治療方法，對于部分病例，臨床上外科手術(shù)切除可以作為主要治療方法；除此之外，對于進(jìn)展期ACC，米托坦聯(lián)合細(xì)胞毒性藥物等為其一線治療方案，但總體治療效果依然有限，腫瘤分期Ⅳ期或者術(shù)后復(fù)發(fā)的ACC患者5年生存率不足5%［4－5］；但是如不施行保守治療，進(jìn)展期患者平均生存期僅為3～9個月［6］。

表皮生長因子受體生理情況下可以誘導(dǎo)正常的有絲分裂反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞分化、遷移與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等，而其表達(dá)異常亦與惡性腫瘤細(xì)胞增殖、粘附、血管形成、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，一直是抗腫瘤分子靶向治療做深入的熱點(diǎn)之一。配體通過與EGFR結(jié)合導(dǎo)致其二聚體話，激活了RAS／MAPK、PI3K等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，EGFR可以通過這些通路調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增加細(xì)胞侵襲力、促進(jìn)血管生成等。人們已經(jīng)在多種實體瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、腎癌中檢測到EGFR的過表達(dá)［7］；同樣，ADAM 等［2］通過對161例 ACC標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，超過90%的ACC腫瘤組織EGFR表達(dá)強(qiáng)陽性，而33例腎上腺腺瘤中32例表達(dá)陰性，另外5例正常腎上腺組織表達(dá)全部陰性。

埃羅替尼是一種小分子靶向治療腫瘤藥物，可以特異性地抑制EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最早于2004年11月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于一線化療失敗的局部晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌的治療，2006年引進(jìn)國內(nèi)。當(dāng)應(yīng)用于腎上腺皮質(zhì)癌SW13細(xì)胞系時，可以明顯地呈濃度－時間相關(guān)地抑制腫瘤細(xì)胞增殖（圖1），當(dāng)作用24h時，埃羅替尼的IC50為20．51μmol／L，當(dāng)濃度增加到50μmol／L時，已能夠大約抑制70%；而當(dāng)作用72h時，即便1μmol／L的埃羅替尼已能夠抑制約60%的細(xì)胞活力。

同時，我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，試圖探討埃羅替尼是否還可以通過影響細(xì)胞凋亡及周期來抑制腫瘤增殖，圖2可以看出與空白組對比，5μmol／L埃羅替尼可使SW13早期凋亡率增加約2倍；當(dāng)濃度增加到20μmol／L時，SW13細(xì)胞早期凋亡率可達(dá)13．49%，增加8．5倍；同樣的現(xiàn)象也發(fā)生在晚期凋亡／壞死的比率上，驗證一定治療劑量的埃羅替尼可以呈濃度相關(guān)地誘導(dǎo)SW13細(xì)胞早期凋亡、促進(jìn)細(xì)胞壞死。除此之外，通過觀察細(xì)胞周期實驗，我們發(fā)現(xiàn)埃羅替尼并不能有效地影響SW13細(xì)胞周期，可能提示埃羅替尼抑制腫瘤增長可能與細(xì)胞周期無關(guān)（圖3）。

EGFR主要通過RAS／MAPK及PI3K／mTOR兩條信號通路來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、分化等，因此我們推測EGFR小分子抑制劑埃羅替尼可能通過這兩條通路來影響SW13細(xì)胞增殖，通過上述兩種濃度的埃羅替尼處理SW13細(xì)胞24h后檢測ERK、mTOR磷酸化及總蛋白的表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)埃羅替尼可以明顯地降低ERK蛋白磷酸化水平，提示其可能通過RAS／ERK信號通路來抑制SW13細(xì)胞增殖（圖4）。另一方面，治療劑量的埃羅替尼并不能影響mTOR蛋白磷酸化水平，其原因可能是兩方面：①M(fèi)ORGILLO等［8］曾報導(dǎo)埃羅替尼在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中能同時抑制RAS／ERK及PI3K兩條通路的激活，從而抑制相應(yīng)細(xì)胞系增殖；但埃羅替尼可能在SW13細(xì)胞系中不通過PI3K／mTOR信號通路抑制細(xì)胞增殖，而僅僅通過RAS這條信號通路；②SW13細(xì)胞經(jīng)埃羅替尼處理后，可能出現(xiàn)了PI3K／mTOR信號通路的補(bǔ)償激活，既往研究亦多次報導(dǎo)IGF1R與EGFR 之間的交聯(lián)存在［8－9］。

雖然本實驗發(fā)現(xiàn)了EGFR小分子抑制劑埃羅替尼對于腎上腺皮質(zhì)癌SW13細(xì)胞系的抑制增殖、促進(jìn)凋亡等作用，但既往人們嘗試將吉非替尼單用、埃羅替尼聯(lián)合吉西他濱應(yīng)用于臨床治療時，并未獲得較好的緩解率［10－11］，可能提示單用EGFR抑制劑并不能獲得良好的治療效果；另外，本實驗結(jié)果提示EGFR下游信號通路可能存在與其他生長因子下游通路之間的交聯(lián)，并結(jié)合其他報道［9］，提示將來可能將EGFR抑制劑與其他相關(guān)酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)用能達(dá)到一定的治療效果。

本研究通過體外應(yīng)用埃羅替尼作用于腎上腺皮質(zhì)癌SW13細(xì)胞系，從細(xì)胞增殖、凋亡、周期及信號通路等多個角度研究埃羅替尼對于ACC腫瘤的影響，揭示了埃羅替尼抑制SW13細(xì)胞腫瘤增殖的作用，為臨床進(jìn)一步將EGFR抑制劑藥物聯(lián)合其他靶向治療藥物應(yīng)用于腎上腺皮質(zhì)癌治療提供了相關(guān)的理論依據(jù)。

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