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FITC-NYZL1分子探針標(biāo)記膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞特異性的研究

2015-07-26 09:02:00羅俊茜龐建智蘇西西楊曉峰
現(xiàn)代泌尿外科雜志 2015年11期
關(guān)鍵詞:細(xì)胞學(xué)膀胱癌探針

羅 芳,張 帆,羅俊茜,姚 紅,龐建智,蘇西西,楊曉峰

(山西醫(yī)科大學(xué):1.微生物與免疫學(xué)教研室;2.第一醫(yī)院泌尿外科,山西太原 030001)

膀胱癌(bladder carcinoma,BC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在泌尿系統(tǒng)疾病中均居首位[1]。雖然其惡性程度低,但復(fù)發(fā)率較高[2]。因此及早發(fā)現(xiàn)和確診、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)、改善預(yù)后是提高膀胱癌患者生活質(zhì)量、降低病死率的主要研究方向。目前膀胱癌的診斷主要以膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)為主,然而三者都存在一定缺陷[3-4]。隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,腫瘤導(dǎo)向肽(tumor targeting peptide,THPs)作為靶向識(shí)別腫瘤的熒光標(biāo)記顯像載體和特異性靶向抗癌藥物結(jié)合受體,在癌癥早期診斷和治療方面的研究取得了巨大進(jìn)展[5]。本課題組前期采用體內(nèi)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)篩選得到膀胱癌BIU-87細(xì)胞系的腫瘤導(dǎo)向肽段 NYZL1[6],本實(shí)驗(yàn)則是驗(yàn)證該多肽與人尿液中癌細(xì)胞結(jié)合的特異性,探討腫瘤導(dǎo)向肽段NYZL1作為膀胱癌檢測(cè)靶向標(biāo)記物的臨床使用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 受檢者資料及分組實(shí)驗(yàn)組:2014年8月至2015年1月山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院66例經(jīng)膀胱鏡檢查診斷為膀胱癌的患者,其中男性40例,女性26例,年齡19~88歲,平均年齡67.27歲。對(duì)照組:選取年齡相仿的膀胱炎患者12例和健康人24名,其中男性26例,女性10例。

1.2 主要試劑及儀器采用體內(nèi)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)篩選得到膀胱癌BIU-87細(xì)胞系的腫瘤導(dǎo)向肽段NYZL1,是由絲氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、精氨酸和組氨酸6種氨基酸組成,兩端以半胱氨酸通過(guò)二硫鍵連接成為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的小分子多肽[6]。由中肽生化有限公司(杭州)合成導(dǎo)向肽段NYZL1并標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC),制備熒光分子FITC-NYZL1,通過(guò)HPLC及 MS純化、鑒定該合成肽段純度≥98%[7];無(wú)菌尿液收集器、4%多聚甲醛液、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液、瑞士-吉姆薩復(fù)合染液、磷酸鹽緩沖液(PBS)等為太原市正合生物化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;SC-04低速恒溫離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);掃描激光共聚焦顯微鏡(LSCM,日本Olympus公司);35 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿(無(wú)錫NEST公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 FITC-NYZL1分子探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn) ①尿液離心、沉淀、固定:2h內(nèi)的新鮮尿液200mL,靜置沉淀0.5h,棄去部分上清液。剩余100mL尿液倒入離心管中,1 300r/min離心10min,棄上清液。加4%多聚甲醛液1mL吹打混勻,室溫下固定細(xì)胞30 min。②樣本滴片、孵育、洗滌:混勻液體,再次離心(1 000r/min,5min),棄上清液。吹打混勻沉淀,取20μL混懸液均勻涂于35mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中,靜置10min。加2mLPBS小心洗滌細(xì)胞2~3次,每次3~5min。加入濃度為5μmol/L FITCNYZL1的溶液1mL,4℃孵育1h。棄去培養(yǎng)皿中溶液,加2mLPBS溶液洗滌細(xì)胞2~3次,每次3~5 min。③細(xì)胞核染色、計(jì)數(shù):暗室中滴加DAPI復(fù)染劑200μL于細(xì)胞區(qū)域,室溫孵育6~8min。棄去培養(yǎng)皿中溶液,加2mL PBS溶液洗滌細(xì)胞2~3次,每次3~5min。加200μL PBS溶液于細(xì)胞區(qū)域,放置于LSCM下鏡檢。計(jì)數(shù):200倍顯微鏡下隨機(jī)取上、下、左、右、中5個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞并計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性(肽結(jié)合)細(xì)胞的百分比(綠色熒光細(xì)胞總數(shù)/100個(gè)細(xì)胞)。

1.3.2 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查 ①尿液收集、離心、滴片:將2h內(nèi)的新鮮尿液200mL靜置約0.5h,棄去部分上清。剩余100mL尿液離心(1 300r/min,10 min),棄上清,滴片,自然干燥后放入95%乙醇中10 min。②樣本染色:滴加0.5~0.8mL瑞-姬染色液于涂片上,并讓染液覆蓋1min。將等體積或2倍體積的PBS緩慢滴加到瑞-吉染色液上面,用洗耳球吹出微風(fēng)使液面產(chǎn)生漣漪狀,兩液體充分混合,染色5~10min。用自來(lái)水緩慢從載玻片一端沖洗,晾干。③樣本封片、鏡檢:待載玻片自然干燥,滴加中性樹(shù)膠、加蓋蓋玻片封片,普通光學(xué)顯微鏡觀察并記錄結(jié)果,由病理科醫(yī)師鑒定,鏡下發(fā)現(xiàn)有惡性腫瘤細(xì)胞判定為檢查陽(yáng)性,其余均判定為檢查陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以±s表示,采用單因素方差分析和卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FITC-NYZL標(biāo)記結(jié)果LSCM下顯示66例膀胱癌患者尿液中都檢測(cè)出與熒光探針結(jié)合的細(xì)胞,陽(yáng)性率為100%(66/66),不同臨床病理分期患者熒光探針與尿脫落細(xì)胞的結(jié)合率為Ta10%~48%(平均30%),T133%~78%(平均57%),T258%~87%(平均73%),T3~471%~93%(平均85%)。而對(duì)照組中尿脫落細(xì)胞與熒光探針特異性結(jié)合率很低,炎性患者0%~10%(平均6.5%),健康人0%~5%(平均3%)(圖1、圖2)。使用單因素方差分析比較,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。FITC-NYZL1對(duì)尿液中膀胱癌細(xì)胞特異性標(biāo)記的結(jié)合率隨腫瘤分期的升高而升高(表1)

圖1 FITC-NYZL1靶向標(biāo)記尿脫落細(xì)胸

表1 膀胱癌不同分期FITC-NYZL1結(jié)合率的比較

圖2 FITC-NYZL1熒光分子探針靶向標(biāo)記圖

2.2 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果膀胱癌患者常規(guī)尿脫落細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性率為18.18%,其中各個(gè)臨床分期的陽(yáng)性率 分 別 為 Ta0% (0/9),T19.1% (2/22),T223.8%(5/21),T3~435.7(5/14)%(圖3)。使用卡方檢驗(yàn)對(duì)FITC-NYZL1標(biāo)記和尿脫落細(xì)胞學(xué)進(jìn)行檢測(cè),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即FITCNYZL1熒光探針可顯著提高膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞中癌細(xì)胞的特異性結(jié)合率。

圖3 尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查圖(Wright-Giemsa,×400)

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤,早期發(fā)現(xiàn)和確診是治療膀胱癌的首要任務(wù)。膀胱鏡檢查作為診斷膀胱癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”,其具有侵入性,可引起尿道損傷及泌尿系感染,且膀胱鏡只能觀察膀胱內(nèi)部結(jié)構(gòu)的表層,對(duì)早期病變及深層結(jié)構(gòu)不能有效識(shí)別,對(duì)微小和扁平狀癌的識(shí)別和定位比較困難,容易導(dǎo)致漏診而不能早期診斷和治療。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查特異性較高(>90%),但靈敏度低(<50%),在低分級(jí)膀胱癌中更顯著[8]。2001年由美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的運(yùn)用FISH探針來(lái)識(shí)別膀胱癌的畸變?nèi)旧w,其靈敏度明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查,但國(guó)內(nèi)FISH技術(shù)仍處在臨床研究階段,靈敏度和特異性與國(guó)外也有多不同[9]。

近年來(lái),隨著光學(xué)分子成像及其探針技術(shù)的發(fā)展,THPs在腫瘤疾病的早期篩查、診斷和治療上都有深入研究。THPs與腫瘤細(xì)胞或腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合,而不與正常細(xì)胞結(jié)合,與單克隆抗體相比,其細(xì)胞穿透力強(qiáng)、穩(wěn)定性好[10]。KOIVISTOINEN等[11]通過(guò)體外噬菌體展示技術(shù)獲得的非小細(xì)胞肺癌導(dǎo)向肽段ARRPKLD能特異性聚集于荷瘤小鼠的腫瘤組織。LEE等[12]通過(guò)T7噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)篩選出人膀胱癌HT-1367細(xì)胞系特異性導(dǎo)向肽CSNRDARRC,并證實(shí)該多肽對(duì)膀胱癌患者的尿液細(xì)胞和病理組織能發(fā)生特異性結(jié)合。JIA等[13]研究認(rèn)為,F(xiàn)ITC-CSNRDARRC導(dǎo)向肽段能與尿液中的膀胱癌細(xì)胞特異性結(jié)合,通過(guò)FITC-CSNRDARRC靶向標(biāo)記、FISH技術(shù)和尿脫落細(xì)胞學(xué)技術(shù)進(jìn)行膀胱癌的診斷,結(jié)果顯示探針靶向標(biāo)記的靈敏度與FISH相比無(wú)明顯差異,與尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查相比均存在顯著差異,在無(wú)創(chuàng)性檢查中靶向標(biāo)記技術(shù)更接近病理組織學(xué)診斷,有望用于腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的早期診斷與治療。這些關(guān)于THPs的研究無(wú)疑使腫瘤疾病實(shí)現(xiàn)早期診斷成為了可能,因而THPs日益受到人們的重視,也有望成為腫瘤臨床應(yīng)用研究的新方向。

本課題組前期采用體內(nèi)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)篩選得到中國(guó)人膀胱癌BIU-87細(xì)胞系的腫瘤導(dǎo)向肽段NYZL1。通過(guò)體內(nèi)外檢測(cè)技術(shù),在細(xì)胞、組織和整體動(dòng)物水平系統(tǒng)地證明膀胱腫瘤導(dǎo)向肽段NYZL1能夠與膀胱癌BIU-87細(xì)胞及其移植瘤靶向性結(jié)合,并可攜帶熒光素FITC標(biāo)記腫瘤組織,是膀胱癌分子靶向診斷的重要載體。本研究我們將多肽應(yīng)用到臨床膀胱腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)中,以膀胱腫瘤患者尿脫落細(xì)胞為研究對(duì)象,分別應(yīng)用FITC-NYZL1分子探針標(biāo)記技術(shù)和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行疾病的診斷,進(jìn)一步驗(yàn)證該小分子探針對(duì)膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞的特異性。研究表明,常規(guī)尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的陽(yáng)性率僅為18.18%,對(duì)早期腫瘤敏感性更差,F(xiàn)ITC-CSSPIGRHC標(biāo)記膀胱癌患者的尿脫落細(xì)胞,即使在Ta期腫瘤仍然能夠檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞,與常規(guī)尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)對(duì)比研究表明靶向肽探針的檢測(cè)可提高尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的靈敏度,提高早期、低級(jí)別膀胱尿路上皮癌的篩查率。FITC-NYZL1靶向檢測(cè)的結(jié)合率也隨著腫瘤分期的升高而升高,相比FISH技術(shù),此技術(shù)更加便捷。此外,我們?cè)谏僭S膀胱炎患者和正常人中也檢測(cè)出微弱的熒光,這可能以尿液暴露于體外導(dǎo)致細(xì)胞成分發(fā)生改變有關(guān),因此在進(jìn)行此項(xiàng)檢查時(shí)一定要收集新鮮尿液,且4℃冰箱保存,必須在短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。

總之,雖然FITC-NYZL1分子探針還處于實(shí)驗(yàn)研究階段,但其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、無(wú)創(chuàng)性、實(shí)驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),很有可能會(huì)在膀胱尿路上皮癌的早期篩查中發(fā)揮更大的作用,成為篩查膀胱尿路上皮癌的一種理想的、新的無(wú)創(chuàng)性檢查方法。

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