夏 韓，哈木拉提·吐送，王文光，王玉杰，張立東

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿中心，烏魯木齊 830054）

腎癌又稱腎細胞癌，其中透明細胞癌約占腎細胞癌的80%左右。腎癌的流行病特征具有顯著的地域分布差異，腎腫瘤發(fā)病率最高出現(xiàn)在捷克共和國，而在亞洲和非洲以及南美人群中報道的發(fā)病率則相對要低［1］，而某些惡性腫瘤（如食管癌）也有較為明顯的地域及民族集聚發(fā)生的特點。早期腎癌缺乏臨床表現(xiàn)，且目前臨床缺乏關于腎癌的特異性血清學檢驗標準，因此尋找腎癌相關腫瘤標記物成為腎癌研究的重要課題及熱點［2－3］。腎臟在調節(jié)血清氨基酸以及清除血液中含氮物質的過程中起核心作用。而腎小管上皮的主要功能之一就是重吸收原尿中的氨基酸。由于絕大多數(shù)腎癌起源于腎小管細胞，而這些腫瘤能改變腎小管重吸收原尿中氨基酸的能力，從而改變血中氨基酸的含量［4］。此外，腫瘤細胞對于氨基酸的需求大于正常細胞，這可能與腫瘤細胞產生能量及增殖方式的改變有關（Warburg效應）［5］。

本實驗運用高效液相色譜法對新疆地區(qū)主要民族漢族及維吾爾族腎癌患者血清中的17種氨基酸進行測定，同時篩選兩族間差異氨基酸，并利用ROC曲線對已測定的漢、維兩民族之間有差異的氨基酸進行分析，探討血清氨基酸的改變對腎癌的診斷價值。

1 材料與方法

1．1 病例選擇收集2010年9月至2012年8月新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科經手術病理診斷確診為原發(fā)性腎透明細胞癌患者96例，其中漢族48例，男34例，女14例；維吾爾族48例，男34例，女14例，肝腎功能正常且排除急性感染、過敏及自身免疫系統(tǒng)疾病，所有腎透明細胞癌均選擇Ⅰ期患者，且手術前未行任何治療。健康對照標本選取年齡、性別、族別相匹配的體檢者，肝、腎功能正常且排除急性感染、過敏、自身免疫性疾病，共入組96例體檢者：漢族48例，男34例，女14例；維吾爾族48例，男34例，女14例。所有采血均經受檢者同意并簽署知情同意書。

1．2 樣品制備病例組患者入院后行普食，治療前抽血。兩組均抽取清晨空腹靜脈血。標本抽取后放入4℃冰箱，1h內處理后放入標本庫－80℃冰箱保存。檢測時從－80℃ 冰箱內取出樣本后使用微量移液器將每份樣品取出200μL，加入400μL乙腈萃取，渦旋30s，靜置10min，4℃、12 000r／min、離心15min，取上清液至EP管中，40℃氮氣吹干，加水200μL復溶后，渦旋30s，使用一次性濾膜過濾后取出10μL按衍生反應要求進行衍生后進樣。

1．3 儀器與方法HPLC色譜儀（美國waters e2695HPLC系統(tǒng)配2475熒光檢測器及軟件工作站），色譜柱（Inertsil C18ODS－SP規(guī)格：5μm，4．6×250mm），渦漩攪拌器（IKA MS 3basic）、微量移液器、pH 計（Sartorius，PB－10）、溶劑過濾裝置、分析天平（Sartorius，BS110S）、氮吹儀、離心機（Thermo型號：Multifuge X3R）、氮吹儀（HSC－12AHENGAO T﹠D）水浴鍋（DK－S22型，上海精宏實驗有限公司），Milli－Q（密理博中國有限公司）。乙腈（色譜純）與甲醇（色譜純）（Sigma－Aldrich試劑公司提供），17種氨基酸標準品（waters，美國）；AccQ－FlourTM試劑盒（由waters公司提供，包括AQC粉末2A、2B（Reagent Diluent Flammable）和硼酸鹽緩沖液各1瓶，臨用前取2A粉末加入2B，渦旋并55℃加熱溶解后使用。

1．4 數(shù)據(jù)處理與分析利用HPLC自動進樣系統(tǒng)進行血清氨基酸的數(shù)據(jù)采集，所采用的數(shù)據(jù)在工作站進行自動積分獲得峰面積，根據(jù)峰面積計算得出氨基酸濃度。在HPLC衍生中，亮氨酸峰與異亮氨酸峰常常融合，在本文圖表中，亮氨酸與異亮氨酸不再分開描述，均表示為亮氨酸＋異亮氨酸。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計學處理，血漿氨基酸濃度以±s表示，均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗，P值取雙側，以0．05為臨界值。

2 結 果

2．1 基本指標將漢族、維吾爾族腎透明細胞癌兩組患者的的基本指標作為研究因素。結果表明，漢族與維吾爾族腎透明細胞癌組之間的基本指標比較均無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0．05，表1）。

表1 兩組腎透明細胞癌患者基本指標比較

表1 兩組腎透明細胞癌患者基本指標比較

基本指標 漢族腎透明細胞癌組維吾爾族腎透明細胞癌組樣本數(shù)48 48年齡（歲） 55．46±8．24 52．45±6．74身高（cm） 167．24±8．21 169．25±9．22體重（kg） 68．41±15．2 70．57±13．1體質量指數(shù) 24．45±2．42 24．64±2．56

表2 漢族、維吾爾族腎透明細胞癌患者與兩族健康人血清氨基酸含量比較

表2 漢族、維吾爾族腎透明細胞癌患者與兩族健康人血清氨基酸含量比較

氨基酸 漢族健康組 漢族腎透明細胞癌組 維族健康組 維族腎透明細胞癌組 P1 P2天冬氨酸 0．027 2±0．003 7 0．015 4±0．007 7 0．029 3±0．005 70．024 8±0．018 8 0．019 0．018谷 氨酸 0．044 6±0．011 7 0．060 5±0．030 4 0．048 4±0．014 3 0．092 7±0．053 0 0．053 0．084絲 氨酸 0．275 7±0．016 8 0．115 6±0．047 7 0．217 8±0．056 7 0．133 7±0．045 2 0．003 0．043甘 氨酸 0．518 9±0．029 6 0．195 8±0．079 3 0．524 1±0．172 4 0．251 2±0．137 4 0．001 0．035組 氨酸 0．547 8±0．010 4 0．062 8±0．031 8 0．534 1±0．184 3 0．061 2±0．038 1 0．002 0．007精 氨酸 0．382 2±0．010 2 0．066 9±0．032 8 0．397 7±0．134 1 0．081 6±0．027 4 0．003 0．007蘇氨酸 0．183 9±0．016 7 0．130 9±0．058 8 0．199 8±0．045 60．144±0．036 3 0．002 0．048

2．2 漢族、維吾爾族腎透明細胞癌患者與兩族健康人血清氨基酸含量的檢測結果漢族與維吾爾族腎透明細胞癌患者的血清氨基酸含量分別與兩族健康人的血清氨基酸含量進行比較。結果顯示，兩族腎透明細胞癌患者血清氨基酸含量較之本族健康人血清氨基酸含量整體呈降低趨勢。其中除谷氨酸外，其他氨基酸的含量均有統(tǒng)計學差異（P＜0．05，表2）。

續(xù)表2 漢族、維吾爾族腎透明細胞癌患者與兩族健康人血清氨基酸含量比較

續(xù)表2 漢族、維吾爾族腎透明細胞癌患者與兩族健康人血清氨基酸含量比較

氨基酸 漢族健康組 漢族腎透明細胞癌組 維族健康組 維族腎透明細胞癌組 P1 P2丙氨酸 0．511 4±0．052 7 0．330 3±0．148 30．588±0．128 5 0．363 3±0．117 4 0．001 0．049脯 氨酸 0．026±0．014 7 0．056 6±0．034 1 0．293 3±0．197 1 0．058±0．040 8 0．004 0．001胱 氨酸 0．176 9±0．005 7 0．041 2±0．021 9 0．193 8±0．065 2 0．048 1±0．021 1 0．000 0．029絡 氨酸 0．103 6±0．008 9 0．076 9±0．036 6 0．101 6±0．037 9 0．088 9±0．024 8 0．000 0．048纈 氨酸 0．325 4±0．056 9 0．281 7±0．222 1 0．337 9±0．053 3 0．242 4±0．064 5 0．028 0．034蛋 氨酸 0．116 5±0．003 9 0．026 2±0．011 6 0．117±0．002 9 0．028 6±0．011 2 0．001 0．043異亮氨酸＋亮氨酸0．153 5±0．011 4 0．086±0．035 5 0．155 2±0．014 5 0．100 1±0．027 6 0．000 0．016苯丙氨酸 0．183 6±0．015 8 0．130 3±0．054 1 0．177 7±0．029 2 0．149 9±0．047 1 0．000 0．018賴氨酸 0．150 6±0．009 1 0．075±0．030 4 0．152 4±0．008 7 0．090 3±0．029 4 0．000 0．013 P1：漢族腎透明細胞癌組與漢族健康人比較；P2：維吾爾族腎透明細胞癌組與維吾爾族健康人比較。

2．3 維吾爾族與漢族腎癌患者血清中氨基酸含量比較維吾爾族與漢族腎癌患者血清中氨基酸含量比較，僅3種氨基酸含量有顯著性統(tǒng)計學差異（P＜0．05，表3）。

表3 維吾爾族與漢族腎癌患者血清中差異有統(tǒng)計學意義的氨基酸

氨基酸 維族腎透明細胞癌組漢族腎透明細胞癌組 P值天冬氨酸0．024 8±0．018 8 0．015 4±0．007 7 0．028甘氨酸 0．251 2±0．137 4 0．195 8±0．079 3 0．015絡氨酸0．088 9±0．024 8 0．076 9±0．036 6 0．041

2．4 天冬氨酸、甘氨酸及絡氨酸血清水平對漢族腎透明細胞癌患者診斷價值的ROC曲線評價本研究中，天冬氨酸、甘氨酸及絡氨酸對應漢族腎癌患者ROC的曲線下面積（area under curve，AUC%）分別為0．536、0．812及0．814，對應維吾爾族腎癌患者的AUC%分別為0．676、0．804及0．876。其中兩民族均以絡氨酸的AUCROC最大（圖1，表4，表5）。

圖1 天冬氨酸、谷氨酸及絡氨酸的血清水平對漢族和維吾爾族腎透明細胞癌患者診斷價值的ROC曲線

表4 天冬氨酸、甘氨酸及絡氨酸血清水平對漢族腎透明細胞癌患者診斷價值的ROC曲線

表5 天冬氨酸、甘氨酸及絡氨酸血清水平對維吾爾族腎透明細胞癌患者診斷價值的ROC曲線

3 討 論

氨基酸是生命活動中最基本的物質，是生命代謝的物質基礎。在腫瘤組織的惡性轉化過程中，由于腫瘤細胞動力學的改變，導致機體出現(xiàn)明顯的代謝異常，主要表現(xiàn)在腫瘤組織蛋白質的合成增強和氨基酸分解減弱，這可能與腫瘤細胞旺盛生長有關。腫瘤組織為了滿足自身的快速生長和細胞的無限制增殖需要從血中攝取某些特定氨基酸，進而引起這些氨基酸在血清中的含量降低［6］。同時腎癌的癌細胞可以侵犯正常腎小管上皮細胞，使腎小管對原尿中的氨基酸重吸收能力降低，從而也可能導致氨基酸在血清中含量的進一步降低。

本研究首先對腎透明細胞癌患者的飲食進行調整，患者入院后盡量行統(tǒng)一普食，以減低氨基酸檢測的干擾因素。再利用高效液相色譜法對漢、維兩民族中腎癌患者血清和正常健康人血清的17種氨基酸進行定量測定，再分別將兩族腎癌患者血清與健康人血清中的17種氨基酸的測定結果進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，漢、維兩族腎癌患者與兩族健康人相比血清存在明顯的氨基酸代謝異常。兩族腎癌患者除谷氨酸外，天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、絡氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸含量呈明顯下降趨勢，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。而漢、維兩族腎癌患者之間存在差異的氨基酸為天冬氨酸、甘氨酸及絡氨酸。

ROC曲線起初用于雷達信號接受能力的評價，后在上世紀90年代被美國國家臨床實驗室標準化委員會批準用作實驗室試驗的臨床準確性評價的準則。它將某試驗的靈敏度及特異性聯(lián)系起來，是一種科學的評測方法。通常用AUC來評價ROC曲線，AUC越大，診斷的價值越大，AUC接近0．5時，無診斷意義；AUC＜0．7，表示診斷準確率較低；AUC在0．7～0．9之間，表示診斷準確性中等；AUC＞0．9時，表示診斷有較高的準確性［7］。本研究中，天冬氨酸、甘氨酸及絡氨酸對應漢族腎癌患者ROC的AUC%分別為0．536、0．812及0．814，而天冬氨酸、甘氨酸及絡氨酸對應維吾爾族腎癌患者的AUC分別為0．676、0．804及0．876。其中兩民族均以絡氨酸的AUCROC最大，診斷價值最高。

本研究結果表明，研究漢、維兩民族之間的差異氨基酸可能為維吾爾族腎癌篩查診斷提供候選生物標志物，初步建立的診斷模型是一種高敏感性、高特異性的篩查診斷方法。在今后的研究中，將擴大樣本數(shù)，進一步對該模型進行驗證，以期待為腎癌的早期診斷提供一條新的方法。

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［7］趙耐清．臨床醫(yī)學研究設計和數(shù)據(jù)分析［M］．上海：復旦大學出版社，2005：241－252．