郭金玉，張鶴曉，吳 丹，高志強(qiáng)，張 冉，張樂萃＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026；3.北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司，北京 101400）

牛腸道病毒2型（bovine enterovirus type 2， BEV－2）是小RNA病毒科、腸道病毒屬成員［1］，通常引起輕度腹瀉或隱性感染，在一定條件下可引發(fā)顯著癥狀，影響奶牛的生產(chǎn)性能。BEV－2基因組為單股正鏈RNA，長為7430bp，僅有一個開放閱讀框（ORF），即RNA 5′末端只含有一個翻譯起始點(diǎn)，編碼2166個氨基酸，經(jīng)降解產(chǎn)生4種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）［2］。其中 VP1蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的中和抗體。

單克隆抗體（McAb）是由一個淋巴細(xì)胞分泌的、針對同一抗原決定簇的抗體，它以高度特異性和敏感性在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究中發(fā)揮著重要作用［3］。

作者利用表達(dá)的牛腸道病毒2型VP1＋蛋白（包含整個VP1蛋白基因片段）為免疫原接種小鼠，通過篩選，制備了抗BEV－2的單克隆抗體，建立了BEV－2雙抗體夾心ELISA檢測方法，為ELISA試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB／c小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；新澤西型水泡性口炎病毒（VSV－NJ）由美國NVSL提供；牛腸道病毒2型（BEV－2病毒，毒株BJ001）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）和牛白血病病毒（BLV）、SP2／0骨髓瘤細(xì)胞均由北京檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供；PEG4000購自北京天來生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；HAT、HT培養(yǎng)基添加劑、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents亞型試劑盒購自SIGMA公司；牛腸道病毒2型陽性血清是用病毒免疫陰性牛制備（中和效價為1∶128）；新澤西型水泡性口炎病毒截短的G蛋白（VSV－NJ－G）、羊抗牛IgG－HRP、弗氏不完全佐劑（FIA）、弗氏完全佐劑（FCA）均由動物疫病診斷聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 免疫原的制備

將原核表達(dá)的重組蛋白質(zhì)BEV－2VP1＋純化復(fù)性后分裝，于－80℃保存，備用。

1.3 小鼠免疫程序及血清抗體效價的測定

選取6～8周齡健康雌性BALB／c小鼠4只，剪耳做標(biāo)記。制定小鼠免疫程序，首免用抗原加FCA（1∶1）充分乳化，頸背部皮下注射，抗原含量50 μg；14d后進(jìn)行二免，用抗原加FIA（1∶1）充分乳化，頸背部皮下注射，抗原含量50μg；間隔2周進(jìn)行三免（同二免）。2周后，斷尾采血并分離血清，用間接ELISA檢測小鼠血清效價，血清效價在1／104以上即可融合，融合前3d小鼠腹腔注射加強(qiáng)免疫。

1.4 細(xì)胞融合及培養(yǎng)

取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2／0細(xì)胞按5∶1的比例用PEG4000進(jìn)行融合，用HAT選擇性培養(yǎng)基輕輕懸浮后混勻，鋪于準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞上［4］。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.5 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆

用重組蛋白質(zhì)BEV－2VP1＋包被酶標(biāo)板后，再用已經(jīng)建立好的檢測BEV－2抗體的間接ELISA方法［5］篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，待融合細(xì)胞覆蓋1／3孔底時，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選出的陽性孔再用BEV－2進(jìn)行2次篩選，最終選出分泌BEV－2抗體的陽性細(xì)胞孔。

將篩選為陽性的雜交瘤細(xì)胞原始孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆?？寺?～5輪，直至細(xì)胞100%檢測陽性，將其擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.6 腹水的制備

選取4只12周齡的小鼠，預(yù)先腹腔注射滅菌石蠟油500μL·只－1，7d后，注射密度約2×106mL－1的陽性雜交瘤細(xì)胞。待小鼠腹部膨脹，收集腹水，8000r·min－1離心5min，置于－20℃保存。

1.7 單抗的間接ELISA效價

將收集的雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水以1／10的比例進(jìn)行倍比稀釋，并設(shè)立陰性對照，結(jié)果以陽性／陰性O(shè)D450nm（P／N）＞2.0時的最高稀釋度確定為單克隆抗體的效價。

1.8 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性和親和力測定

將雜交瘤細(xì)胞反復(fù)凍存復(fù)蘇3次，并連續(xù)傳代培養(yǎng)至第6代，檢測凍存前、復(fù)蘇后及傳至第6代的雜交瘤細(xì)胞分泌McAb的穩(wěn)定性。

利用亞型試劑盒測定兩株單抗的亞型，參考親和力測定文獻(xiàn)［6］，測定其親和力。

1.9 病毒與腹水反應(yīng)

將粗純的BEV－2病毒在56℃滅活30min。用pH 9.6碳酸鹽緩沖液將病毒（BEV－2）1∶100倍稀釋，同時設(shè)BVDV（1∶100倍稀釋）做陰性對照，包被至反應(yīng)板，經(jīng)封閉、洗滌后，加入1∶（103～107）稀釋的腹水，用羊抗鼠IgG－HRP檢測反應(yīng)結(jié)果。

1.10 單抗特異性

將滅活后的病毒（BEV－2、VSV、BVDV 和BLV）用碳酸鹽緩沖液1∶100倍稀釋，分別包被酶標(biāo)板，收集腹水進(jìn)行ELISA測定。

1.11 免疫印跡分析

取純化的重組蛋白質(zhì)VSV－NJ－G、BEV－2 VP1＋進(jìn)行SDS－PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF，封閉后加入一抗（腹水1∶100倍稀釋）4℃孵育過夜，洗滌后加羊抗鼠IgG－HRP（1∶8000倍稀釋），最后洗滌3次，避光顯色1min，與底片一起置于暗盒中，曝光1～5min。

1.12 雙抗體夾心ELISA方法的建立

1.12.1 單抗和酶標(biāo)抗體稀釋度的確定 將制備的單克隆抗體做1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000稀釋后加入酶標(biāo)板，放置37℃孵育1h，4℃包被過夜；封閉后加入1∶100稀釋病毒抗原37℃孵育1h；再加入1∶100稀釋的BEV－2陽性血清；將羊抗牛IgG－HRP做1∶500、1∶1000、1∶2000稀釋。測定OD450nm值，選擇陽性值接近1.0時對應(yīng)的單抗和酶標(biāo)抗體稀釋度。

1.12.2 封閉液的確定 單抗最佳包被條件確定后，分別用1%明膠的PBST、1%卵清蛋白的PBST進(jìn)行封閉，比較封閉效果。

1.12.3 酶標(biāo)抗體和底物顯色時間的優(yōu)化 將羊抗牛IgG－HRP按最佳稀釋度稀釋，分別作用0.5、1、2h；加入底物后分別在黑暗中顯色10、15、30 min，測其OD450nm。

1.12.4 臨界值的確定 用優(yōu)化的雙抗體夾心ELISA方法檢測40份病毒分離均為陰性的正常牛腸道拭子，采集的腸道拭子樣品加入到1mL PBS緩沖液中，充分混勻，離心，取上清。計算臨界值。

1.12.5 雙抗體夾心ELISA特異性試驗(yàn) 用優(yōu)化的雙抗體夾心ELISA方法，檢測BVDV、IBRV、BLV、BEV－2，驗(yàn)證雙抗體夾心ELISA方法的特異性。

1.12.6 雙抗體夾心ELISA敏感性試驗(yàn) 采集30份牛腸道拭子，用細(xì)胞培養(yǎng)法分離病毒并與雙抗體夾心ELISA方法比較。

用BEV－2毒株感染MDBK細(xì)胞，進(jìn)行3次病毒細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）測定，以平均值作為該病毒的含量［7］，按病毒含量將病毒稀釋為0.01、0.1、1、10、100、1000TCID50·0.1mL－1，用雙抗體夾心ELISA確定BEV－2的最小檢測量，與熒光定量RT－PCR檢測結(jié)果比較。

1.12.7 雙抗體夾心ELISA重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)測定的病毒TCID50，將BEV－2細(xì)胞培養(yǎng)物做十倍比稀釋:10－1、10－2、10－3、10－4，并用正常細(xì)胞培養(yǎng)液做陰性對照。在同一酶標(biāo)板重復(fù)三次，計算板內(nèi)變異系數(shù)（CV）；在三個批次的酶標(biāo)板（板1、板2、板3）重復(fù)，計算板間變異系數(shù)（CV）。

1.12.8 臨床樣品的檢測 采集牛腸道拭子、口腔拭子及糞便分泌物共236份臨床樣品，用雙抗體夾心ELISA方法檢測。從中選取25份陽性、20份陰性樣品用病毒分離鑒定方法復(fù)檢，并與雙抗體夾心ELISA方法的結(jié)果比較。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠血清抗體效價的測定

結(jié)果顯示（表1），BALB／c小鼠的血清抗體效價均在1／104以上，4＃號免疫效果最好，用于細(xì)胞融合。

表1 小鼠血清抗體效價檢測Table 1 The antibodies level of serums of mices

2.2 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選與建立

通過對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測，最終獲得2株分泌抗BEV－2VP1＋蛋白 McAb的雜交瘤細(xì)胞株:1G1、5G6。經(jīng)3次有限稀釋法亞克隆后，雜交瘤細(xì)胞陽性率達(dá)100%。

2.3 單抗的間接ELISA效價

經(jīng)檢測，1G1、5G6兩株雜交瘤細(xì)胞上清產(chǎn)生的抗體效價為1／104、1／106。2株單抗的小鼠腹水效價比雜交瘤細(xì)胞上清效價高，1G1株單抗的效價為1／105，5G6株單抗的效價可達(dá)1／107（表2）。

表2 間接ELISA中2株單抗細(xì)胞上清及腹水效價Table 2 Supernatant and ascitic fluid titers of two McAbs in indirect ELISA

2.4 雜交瘤細(xì)胞分泌McAb的穩(wěn)定性和親和力測定

兩株雜交瘤細(xì)胞上清在凍存前、復(fù)蘇后、傳代后的OD450nm無明顯變化，能穩(wěn)定地分泌抗BEV－2的McAb（圖1）。

圖1 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性測定Fig.1 The ability to secretory antibody of the hybridoma cell

利用亞型試劑盒測定1G1、5G6的亞型分別為IgG1及IgG2b，根據(jù)親和力測定文獻(xiàn)測定其親和力分別為6.5×109、2.0×1010，兩者都屬于高親和力抗體。選擇5G6做進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.5 病毒與腹水5G6反應(yīng)

檢測結(jié)果（表3）顯示，BEV－2與腹水5G6反應(yīng)良好，效價可達(dá)1／105。

表3 病毒與腹水反應(yīng)結(jié)果Table 3 Results of virus and ascitic fluid titers

2.6 單抗5G6的特異性

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示（結(jié)果未展示），5G6細(xì)胞株小鼠腹水僅與BEV－2反應(yīng)呈陽性，與其他病毒反應(yīng)為陰性，具有良好的特異性。

2.7 單抗5G6的免疫印跡分析

Western blot鑒定結(jié)果表明，5G6株單克隆抗體能與大腸桿菌表達(dá)的BEV－2VP1＋重組蛋白質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)（圖2）。

2.8 單抗5G6雙抗體夾心ELISA方法建立

2.8.1 包被單抗?jié)舛群兔笜?biāo)抗體濃度的確定經(jīng)測定，確定單抗5G6最佳稀釋度為1∶4000，羊抗牛IgG－HRP稀釋度為1∶1000（表4）。

2.8.2 封閉液的確定 試驗(yàn)結(jié)果證明，用1%卵清蛋白的PBST封閉時P／N最大，所以最終選擇1%卵清蛋白的PBST作為封閉液。

圖2 單克隆抗體的免疫印跡分析Fig.2 Analysis of monoclonal antibodies by Western blotting

表4 5G6包被濃度和酶標(biāo)抗體稀釋度的確定Table 4 Confirmation of 5G6coating concentration and IgGHRP using concentration

2.8.3 酶標(biāo)抗體和底物顯色時間的優(yōu)化 酶標(biāo)抗體和底物反應(yīng)時間的選擇試驗(yàn)結(jié)果顯示，羊抗牛IgG－HRP反應(yīng)時間為0.5h時；底物作用時間為15min。

2.8.4 臨界值的確定 通過計算，得出40份牛腸道拭子的平均值為0.1496，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0541。因此，確定該方法的臨界值為0.31。

2.8.5 雙抗體夾心ELISA特異性試驗(yàn) 用雙抗體夾心ELISA方法檢測BVDV、IBRV、BLV均無交叉反應(yīng)，顯示了雙抗體夾心ELISA方法特異性較好。

2.8.6 雙抗體夾心ELISA敏感性試驗(yàn) 通過表5結(jié)果計算，雙抗體夾心ELISA方法與病毒分離鑒定方法的陽性符合率為90%，陰性符合率為100%，總符合率為93.3%。

表5 病毒分離與雙抗體夾心ELISA比較試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of viral isolation compared with DAS－ELISA

經(jīng)3次BEV－2病毒含量測定，確定其平均值為10－6.48TCID50·0.1mL－1。雙抗體夾心ELISA檢測結(jié)果表明:當(dāng)BEV－2含量低于10TCID50·0.1mL－1的時，檢測結(jié)果陰性；當(dāng)含量≥100TCID50·0.1 mL－1時為陽性。該方法對BEV－2的檢測極限為100TCID50·0.1mL－1。而熒光定量RT－PCR檢測方法的檢測極限為0.1TCID50·0.1mL－1，比雙抗體夾心ELISA的敏感性高（表6）。

表6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果（x－±s）Table 6 Results of the sensitivity tests（x－±s）

2.8.7 雙抗體夾心ELISA重復(fù)性試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測的BEV－2細(xì)胞培養(yǎng)物變異系數(shù)（CV）均小于3%，表明該方法在板內(nèi)、板間有良好的重復(fù)性。

2.8.8 臨床樣品的檢測 雙抗體夾心ELISA方法檢測236份臨床樣品，結(jié)果58份為BEV－2陽性，陽性率為24.6%。從中選取的45份樣品（25份陽性、20份陰性）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒（表7），兩者結(jié)果的總符合率為91.1%。

表7 病毒分離與雙抗體夾心ELISA符合率試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of the coincidence test between virus isolation and the DAS－ELISA

3 討 論

本研究以純化的重組蛋白質(zhì)BEV－2VP1＋作為抗原，對BALB／c小鼠進(jìn)行常規(guī)免疫，通過2次細(xì)胞融合，接種768孔，用間接ELISA方法篩選后進(jìn)行了3次亞克隆，最終獲得2株能夠穩(wěn)定分泌抗BEV－2McAb的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)檢測，5G6株單克隆抗體具有良好的特異性。在國內(nèi)，本試驗(yàn)首次制備了BEV－2的單克隆抗體。用制備的5G6株單克隆抗體包被酶標(biāo)板，通過一系列的優(yōu)化，建立了BEV－2雙抗體夾心ELISA檢測方法。

制備單克隆抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是細(xì)胞融合。骨髓瘤細(xì)胞形態(tài)不飽滿、折光性較差，容易導(dǎo)致融合失敗，細(xì)胞死亡。因此，細(xì)胞生長狀態(tài)對融合起決定性作用，一定要保證骨髓瘤細(xì)胞的活力。除此之外，脾細(xì)胞的生長狀態(tài)、融合比例及方法、試驗(yàn)過程中的操作都會影響細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞生長狀況。

在國外牛群中，BEV陽性率高達(dá)17.6%～80%。BEV通過糞便或經(jīng)口傳播，傳染源主要為病牛和無癥狀的病毒攜帶者［8］。吳丹等也曾報道過北京部分地區(qū)牛群存在牛腸道病毒感染，她建立的TaqMan熒光定量RT－PCR檢測方法的敏感性為0.1TCID50·0.1mL－1。2014年侯佩莉等［9］報道山東也存在牛腸道病毒感染，并建立了RT－PCR檢測方法，其檢出敏感度也是10－1TCID50·0.1 mL－1。本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA方法敏感性沒有熒光 RT－PCR 高，為100TCID50·0.1 mL－1，但是該方法與BVDV、IBRV、BLV均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，而且雙抗體夾心ELISA方法檢測的是抗原，無需病毒RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增及電泳檢測等過程，使用常規(guī)儀器即可操作。與其他檢測方法相比操作簡便、成本低。

雙抗體夾心ELISA方法和病毒分離的符合率試驗(yàn)顯示兩種方法符合率很高，總符合率達(dá)91.1%。病毒分離作為一種傳統(tǒng)的金標(biāo)檢測方法，建立病原檢測方法時都與其進(jìn)行比較。本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法雖然存在一定的假陰性、假陽性，但較病毒分離相比，更適用于大批量樣品的初篩。這種方便快捷的檢測方法是生產(chǎn)實(shí)際中迫切需要的，適用于臨床檢測。

4 結(jié) 論

本研究在國內(nèi)首次制備了2株抗BEV－2的單克隆抗體，首次建立了檢測BEV－2抗原的ELISA方法。該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，適用于大批量樣品的初篩，為我國出入境BEV的檢驗(yàn)檢疫和國內(nèi)外牛腸道病毒ELISA試劑盒的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

（References）:

［1］SMYTH M S，MARTIN J H.Structural，biochemical and electrostatic basis of serotype specificity in bovine enteroviruses［J］.Arch Virol，2001，146（2）:347－355.

［2］MCCARTHY F M，SMITH G A，MATTICK J S.Molecular characterisation of Australian bovine enteroviruses［J］.Vet Microbiol，1999，68（1－2）:71－81.

［3］侯 強(qiáng)，彭伍平，孫 元，等.豬瘟病毒E2蛋白主要抗原區(qū)編碼基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38（1）:1－5.HOU Q，PENG W P，SUN Y，et al.Expression of the truncated E2protein－encoding gene of classical swine fever virus in Escherichia coli and preparation of a monoclonal antibody against E2protein［J］.Chinese Veterinary Science，2008，38（1）:1－5.（in Chinese）

［4］K?HLER G，MILSTEIN C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity［J］.Nature，1975，256（5517）:495－497.

［5］郭金玉，高志強(qiáng)，張鶴曉，等.牛腸道病毒2型VP1＋表達(dá)和間接ELISA方法的建立與應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)雜志，2014，50（11）:40－43.GUO J Y，GAO Z Q，ZHANG H X，et al.Development and application of indirect ELISA for the detection of antibodies against bovine enterovirus type 2 based on VP1＋protein expression［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2014，50（11）:40－43.（in Chinese）

［6］張小兵，吳 萌，閆靜輝.ELISA法快速測定 McAb培養(yǎng)上清中鼠源IgG質(zhì)量濃度［J］.河北省科學(xué)院學(xué)報，2008，25（2）:49－52，76.ZHANG X B，WU M，YAN J H.Rapid measurement of the mouse IgG concentration by a sandwich ELISA［J］.Journal of the Hebei Academy of Sciences，2008，25（2）:49－52，76.（in Chinese）

［7］吳 丹，吳 濤，張鶴曉，等.牛腸道病毒TaqMan熒光定量RT－PCR檢測方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（11）:903－906.WU D，WU T，ZHANG H X，et al.Establishment of real－time RT－PCR method for detection of bovine enterovirus［J］.Chinese Journal of Preventive Veteri－nary Medicine，2014，34（11）:903－906.（in Chinese）

［8］BLAS－MACHADO U，SALIKI J T，SáNCHEZ S，et al.Pathogenesis of a bovine enterovirus－1isolate in experimentally infected calves［J］.Vet Pathol，2011，48（6）:1075－1084.

［9］侯佩莉，程洪兵，劉 曉，等.牛腸道病毒RT－PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（2）:13－16.HOU P L，CHENG H B，LIU X，et al.Establishment and application of RT－PCR for detection of bovine enterovirus［J］.Shandong Agricultural Sciences，2014，46（2）:13－16.（in Chinese）