陳孜孟，董 宣，蘇 帥，崔 寧，李 卓，崔治中＊

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，泰安 271018；2.國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005）

禽白血病病毒（avian leucosis virus，ALV）是反轉(zhuǎn)錄病毒科α－反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員之一。根據(jù)病毒在不同種禽類的宿主范圍，病毒間的干擾作用及病毒中和反應(yīng)相關(guān)的囊膜蛋白抗原特性，禽白血病病毒分為A～J 10個(gè)亞群，A、B、C、D、E和J等6個(gè)亞群可感染雞［1］。近年來王鑫等［2］也分離到了新的K亞群ALV。其中E亞群為內(nèi)源性ALV，通常致病性很低或無致病性，其余均為對(duì)雞有致病性的外源性ALV。內(nèi)源性ALV是指整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體基因組的可通過染色體垂直傳播的ALV前病毒DNA及其可能產(chǎn)生的ALV病毒粒子。它可能只是病毒基因組的不完整片段，不會(huì)產(chǎn)生傳染性病毒；但也可能是全基因組因而能產(chǎn)生有傳染性的病毒粒子，不過這類病毒通常致病性很弱或沒有致病性［3］。內(nèi)源性的ALV－E雖然沒有致病性，但它可干擾對(duì)外源性ALV感染的檢測(cè)，給診斷和凈化ALV 帶來很大的困難［4－5］。

在內(nèi)源性ALV這個(gè)大概念中，既包括在三十多年前就在雞基因組上發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的內(nèi)源性白血病病毒（endogenous viruses，ev）位點(diǎn)［6］，還有近二十多年中發(fā)現(xiàn)的中度重復(fù)性序列EAV（endogenous avian virus）［7］、ART－CH （avian retrotransposon from chicken genome）［8］及高度 重復(fù) 性序 列 CR1（chicken repeat 1）［9］。雞的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒只是在真核生物中存在的許多反轉(zhuǎn)錄序列的突出例子。

雞的ev位點(diǎn)的遺傳序列與E亞群ALV相關(guān)，幾乎所有正常雞都帶有完整的或缺陷性的ALV－E基因組［10］。這些ev位點(diǎn)分布在雞的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的不同的染色體上，并以孟德爾遺傳法則遺傳給它們的不同性別的后代［11－12］。迄今為止，已至少識(shí)別和鑒定出50個(gè)不同的ev位點(diǎn)，其中在白來航雞中確認(rèn)的有22個(gè)［13］。這些位點(diǎn)分別是在20世紀(jì)70、80年代通過RELP和分子雜交的方法從不同品種雞鑒定和識(shí)別出來［6，14］。其中只有ev21這個(gè)位點(diǎn)是從海蘭雞發(fā)現(xiàn)的［12］。有些位點(diǎn)的染色體定位已經(jīng)確定，有的尚待鑒定［15－18］。隨著雞基因組序列測(cè)定的完成［19］，其他ev位點(diǎn)的定位也會(huì)逐漸完成。但是，迄今為止，大多數(shù)ev位點(diǎn)只是完成了染色體定位，尚未完成克隆和測(cè)序。要強(qiáng)調(diào)說明的是，這些特定位點(diǎn)是穩(wěn)定地整合進(jìn)雞細(xì)胞基因組，因此能夠按孟德爾法則遺傳。

目前國內(nèi)外對(duì)ALV鑒定報(bào)道，都是擴(kuò)增其中的env片段或分段擴(kuò)增三個(gè)基因片段后進(jìn)行拼接得到的 ALV 序列［20－24］。在2011年X.Wang（王興娜）等［25］從深海分離到一株超嗜熱古菌，并重組表達(dá)了其Pol B DNA聚合酶并具有擴(kuò)增長(zhǎng)片段的能力（相關(guān)文章尚未發(fā)表）。本研究利用超嗜熱古菌Thermococcus sp.4557來源重組表達(dá)的Pol B DNA聚合酶，通過一次PCR反應(yīng)從海蘭雞中染色體基因組DNA擴(kuò)增到4663bp的包含gag、pol、env部分基因片段和3′－LTR的內(nèi)源性ALV－E位點(diǎn)，本文對(duì)其做了全面的比較分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)室人工造病，感染ALV－J的海蘭雞頸部腫瘤組織和正常海蘭雞頸部組織提取的基因組DNA；DNA聚合酶由國家海洋局第三海洋研究所重組表達(dá)的從超嗜熱古菌Thermococcus sp.4557來源的重組表達(dá)的Pol B DNA聚合酶；Top10感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒小提試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；通用型DNA純化回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；rTaq DNA聚合酶和pMD18－T購于TaKaRa公司。

1.2 長(zhǎng)距離PCR

參照GenBank上發(fā)表的ALV毒株（NX0101［23］，登錄號(hào)為DQ115805；ev－1［26］，登錄號(hào)為 AY013303；JS11C1［24］，登錄號(hào)為 KF746200；SDAU09C2，登錄號(hào)為 HM446005）序列，設(shè)計(jì)5′LTR右側(cè)外的5′UTR區(qū)段設(shè)計(jì)上游引物，在3′LTR右端區(qū)段設(shè)計(jì)下游引物。設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物如下，Primer F:5′－TTTGGTGACCCCGACGTGATAGTTAGGGAATAGTGGTCG－3′，Primer R:5′－TGAAGCCTTCCGCTTCATGCAGGTGTTCG－3′。使用從超嗜熱古菌Thermococcus sp.4557來源的重組表達(dá)的Pol B DNA聚合酶，配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50μL:Tris（pH8.8）20mmol·L－1，MgSO42mmol·L－1，KCl 10mmol·L－1，（NH4）2SO410mmol·L－1，TritonX－1000.5‰，Trehalose 100mmol·L－1，dNTP 0.2mmol·L－1，BSA 20mg·L－1，F(xiàn) 50μmol·L－1，R 50μmol·L－1，Template DNA 100ng，Pol B DNA polymerase 1μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃5 min；變性95℃30s，梯度退火72～52℃30s，延伸72℃5min，35個(gè)循環(huán)；后延伸72℃10min，4℃終止反應(yīng)。感染ALV－J的海蘭雞頸部腫瘤組織提取的基因組DNA為試驗(yàn)組，正常海蘭雞頸部組織提取的基因組DNA為對(duì)照組。

1.3 重組載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物電泳切膠回收，使用rTaq DNA聚合酶按照產(chǎn)品說明配制反應(yīng)體系，將模板DNA改為切膠純化的PCR產(chǎn)物，72℃延伸30min，使用天根通用型DNA純化回收試劑盒對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，產(chǎn)物克隆至pMD18－T，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，搖菌提取質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ單酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到約7000bp大小條帶的質(zhì)粒，送上海美吉生物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.4 基因組序列的比較分析

使用Genetyx和Chromas2軟件測(cè)序結(jié)果進(jìn)行剪輯和拼接，使用MegAline軟件對(duì)測(cè)序拼接結(jié)果與國內(nèi)外已發(fā)表的不同亞群ALV基因組序列進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 ALV基因組的擴(kuò)增

提取的組織基因組經(jīng)過NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)后，將基因組樣品稀釋到100 ng·μL－1作為模板使用。感染ALV－J海蘭雞頸部腫瘤組織基因組擴(kuò)增到約4.3kb大小的DNA片段（圖1A）。為了確定它與外源性白血病病毒cDNA的關(guān)系，又使用正常海蘭雞頸部組織提取基因組做模板進(jìn)行擴(kuò)增，也擴(kuò)增到同樣約4.3kb大小的DNA片段（圖1B）。

圖1 ALV－E基因組擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of ALV－E

2.2 重組載體的構(gòu)建

將不同模板擴(kuò)增的4.3kb大小的DNA片段進(jìn)行切膠回收，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)后，將擴(kuò)增的DNA末端使用rTaq進(jìn)行3′端加A后，進(jìn)行純化，連接pMD18－T，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，搖菌提取質(zhì)粒后，使用SalⅠ單酶切，選擇得到約7000bp大小DNA條帶的克隆，送上海美吉生物測(cè)序，確定含有4300bp的內(nèi)源性ALV部分基因組序列，定名為UL－E1。

2.3 對(duì)測(cè)序序列的分析

使用Genetyx和Chromas2對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和校正，得到完整的序列。對(duì)以ALV感染海蘭雞頸部腫瘤組織基因組和無外源性ALV感染的正常海蘭雞頸部組織基因組為模板分別擴(kuò)增的序列做了比較分析，二者大小都為4663bp，相似性為100%，表明該片段來自正常雞細(xì)胞基因組的內(nèi)源性ALV，而與感染的外源性ALV無關(guān)。

將測(cè)序拼接得到的基因組序列與NCBI網(wǎng)站上的同源序列進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)與許多白血病病毒的基因組序列相似性最高達(dá)99%，在該內(nèi)源性ALV片段中，LTR全長(zhǎng)274bp，3個(gè)主要結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env片段的大小分別為2013、728和1046bp，與完整的ALV基因組的相應(yīng)基因相比都有嚴(yán)重缺失（圖2）。其中與在原雞4號(hào)染色體上的ev位點(diǎn)內(nèi)源性 ALVE－B10［27］（GenBank 登錄號(hào):KC610516）同源性最高，但是相比ALVE－B10基因組序列缺失嚴(yán)重，分別在gag、pol、env三個(gè)主要功能基因中位置缺失了93、1960和805個(gè)堿基。

2.4 與原雞的基因組其他序列的比較

在GenBank上找到原雞的基因組序列，HL－E1序列直接與原雞基因組序列進(jìn)行比對(duì)，在1號(hào)染色體（GenBank登錄號(hào):NC006088）第32561736—32568956（測(cè)序gap）堿基位置之間找到了同源序列，相似性99.2%。把這段序列拷貝下來，使用Genetyx進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，相比原雞1號(hào)染色體序列在32563954—32563686、32564811—32566771和32567340—32568147堿基位置分別缺失了93、1960和808個(gè)堿基。

圖2 HL－E1結(jié)構(gòu)示意Fig.2 Schematic illustration of HL－E1

2.5 與其他亞群白血病病毒全基因組序列比較分析

HL－E1全基因組核苷酸序列與 ALV－A（SDAU09C1，登錄號(hào)為HM452339）、ALV－B（SDAU09C2，登錄號(hào)為 HM446005）、ALV－E（ev－1［26］，登錄號(hào)為 AY013303）、ALV－J（NX0101［23］，登錄號(hào)為 DQ115805）和 ALV－K［2］（JS11C1［24］，登錄號(hào)為KF746200）的代表毒株進(jìn)行序列比較，結(jié)果顯示:該內(nèi)源性ALV片段與幾個(gè)不同亞群的代表株的完整病毒粒子中的基因組相比，其gag、pol、env都發(fā)生了嚴(yán)重缺失（表1），其env基因片段與E亞群ev－1的env基因相似性最高，達(dá)96.8%，HL－E1的LTR與ev－1和TW－3593的LTR長(zhǎng)度相同，比較之下HL－E1的基因組大小明顯小于其他ALV亞群（表1）。此外，通過對(duì)比HL－E1存在的三個(gè)缺失基因序列對(duì)應(yīng)其他亞群的同源序列，統(tǒng)計(jì)了HL－E1與其他亞群三個(gè)主要功能基因和LTR的相似性（表2）。

表1 HL－E1與各亞群外源性ALV毒株基因組和雞基因組內(nèi)源性ALV成分的大小比較Table 1 Comparison of HL－E1strains with other subgroups ALV genes and genome size bp

表2 HL－E1與各亞群外源性ALV毒株基因組和雞基因組內(nèi)源性ALV成分序列相似性比較Table 2 Comparison of HL－E1strains with other subgroups ALV three genes and LTR homologous %

3 討 論

利用自行研制的超嗜熱古菌Thermococcus sp.4557來源重組表達(dá)的Pol B DNA聚合酶能擴(kuò)增長(zhǎng)片段DNA的特點(diǎn)（待發(fā)表），本研究最初試圖通過一次PCR從雞的急性肉瘤病料基因組DNA中擴(kuò)增缺陷型急性致腫瘤ALV的全基因組，并得到了一個(gè)4663bp的片段。但在對(duì)照試驗(yàn)中，用相同的酶和引物，從未感染ALV的健康海蘭雞的細(xì)胞基因組DNA也擴(kuò)增到序列完全相同的片段HL－E1，這表明該片段實(shí)際上只是正常雞基因組的一個(gè)組成部分。序列分析表明，對(duì)該片段全長(zhǎng)4663bp，分別包含gag、pol、env三個(gè)基因的部分序列及其3′－LTR（表1）。在HL－E1序列中LTR全長(zhǎng)274bp；三個(gè)主要ORF編碼的基因gag、pol、env的長(zhǎng)度分別為2013、728和1046bp，與不同亞群的完整的ALV基因組上這三個(gè)基因相比都發(fā)生了很大的缺失。該片段env基因和LTR都與雞基因組上經(jīng)典的ev1位點(diǎn)的相應(yīng)基因有96.8%和97.4%的相似性，而與其他亞群的外源性ALV的相似性較低（表2）。這表明這是整合進(jìn)海蘭雞染色體基因組中的一個(gè)內(nèi)源性E亞群ALV片段構(gòu)成的ev位點(diǎn)。雖然到目前為止已分別從不同品系的正常雞基因組識(shí)別和鑒定出50個(gè)不同的ev位點(diǎn)［13］，但這些位點(diǎn)分別是在20世紀(jì)70、80年代通過RELP和分子雜交的方法從不同品種雞鑒定和識(shí)別出來［14，15］。這些ev位點(diǎn)既有E亞群ALV完整的序列，如ALVE－B10等［18］，還有很多都是缺陷型的不完整基因組，其中只有少數(shù)幾個(gè)有序列報(bào)道，如ev1。到目前為止，從海蘭雞基因組還只有發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了ev21這個(gè)位點(diǎn)［12］，這是與雞的快慢羽性狀相關(guān)基因緊密連鎖的一個(gè)ev位點(diǎn)，它包括了完整的E亞群ALV全基因組。本研究克隆鑒定的HL－E1這個(gè)基因位點(diǎn)是不完整片段，顯然這是不同于ev21的海蘭雞基因組上的又一個(gè)ev位點(diǎn)。

將HL－E1的序列與原雞的基因組草圖序列比對(duì)時(shí)，只在原雞的1號(hào)染色體的第32561736—32568956（此端為測(cè)序gap）堿基之間找到了同源序列，相似性99.2%，HL－E與原雞的此段同源序列相比也在1859—1951、3076—5036和5605—6412位置缺失了93、1960和808個(gè)堿基，其他位點(diǎn)沒有找到同源序列。但該序列與從原雞4號(hào)染色體擴(kuò)增到的ALVE－B10（內(nèi)源性E亞群位點(diǎn)）的同源性更高（表1和表2），根據(jù)我們現(xiàn)有的研究結(jié)果還很難推斷本研究擴(kuò)增得到的HL－E1的位點(diǎn)是在海蘭雞的哪一條染色體上。這一內(nèi)源性ALV－E位點(diǎn)是否會(huì)影響相應(yīng)品系雞的某種遺傳性狀也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

使用超嗜熱古菌Thermococcus sp.4557來源重組表達(dá)的Pol B DNA聚合酶通過一次PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增到了位于海蘭雞染色體基因組的一個(gè)新的ev位點(diǎn)HL－E1。其LTR全長(zhǎng)274bp，3個(gè)主要結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env片段的大小分別為2013、728和1046bp，與完整的ALV基因組的相應(yīng)基因相比都有嚴(yán)重缺失。

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