甘 翔，王繼文，劉賀賀，李 亮，孫文強(qiáng)，王郁石，張 濤，陳 達(dá)，黃惠蘭

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

NF－κB1與 NF－κB2共同隸屬于 NF－κB基因家族，分別編碼p50與p52的前體蛋白p105和p100。p105與p100是核轉(zhuǎn)錄因子，在二聚體化后能與免疫球蛋白輕鏈（Immunoglobulin light chain，MYLC）基因增強(qiáng)子cDNA序列（5′－GGGACTTTCC－3′）特異性結(jié)合并調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)和調(diào)節(jié)眾多免疫和炎癥反應(yīng)［1－2］。NF－κB1／2擁有Rel homology domain（RHD）、IPT domain（IPT）、ankyrin repeats（ANK）和 Death domain（DD）4個(gè)結(jié)構(gòu)域［3］。RHD由大約200個(gè)氨基酸殘基組成，擁有核定位信號(hào)序列，是與DNA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，也是與抑制劑作用的重要區(qū)域；ANK可作為NF－κB家族的抑制劑，通過(guò)與RHD結(jié)合來(lái)使其滯留在細(xì)胞質(zhì)并保持靜息態(tài)，ANK蛋白的磷酸化、泛素化、降解釋放RHD的過(guò)程也就是NF－κB蛋白的激活過(guò)程［4］；而IPT和DD則與NF－κB蛋白二聚體的穩(wěn)定性與活性有著密切的聯(lián)系［5］。

研究表明，NF－κB基因的原始結(jié)構(gòu)起源于后生動(dòng)物以前，在進(jìn)化過(guò)程中分化為 NF－κB1和 NF－κB2［6］。利用模式脊椎動(dòng)物的 NF－κB1／2氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)它們分成兩支，且完全沒(méi)有交叉的跡象，說(shuō)明兩者在進(jìn)化上出現(xiàn)了明顯的分歧，暗示它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上存在一定差異。另外，在脊椎動(dòng)物中，NF－κB1／2蛋白的功能也表現(xiàn)出了一定的差異。有文獻(xiàn)報(bào)道［7－8］，不同的 NF－κB1／2蛋白二聚體對(duì)于相應(yīng)的κB位點(diǎn)會(huì)顯示出不同的親和力與激活能力。不僅如此，兩者的ANK抑制結(jié)構(gòu)對(duì)于不同的二聚體也可能顯示出不同的抑制強(qiáng)度。還有報(bào)告［7－9］稱，許多刺激信號(hào)如 TNF－α、IL－1、LPS等對(duì) NF－κB1和NF－κB2氨基酸序列的刺激能力與刺激途徑也有所差異。在小鼠中，敲除NF－κB1會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞的多種功能缺陷，而敲除NF－κB2則會(huì)引起淋巴結(jié)構(gòu)改變，影響上皮發(fā)育。另外，兩者的敲除反應(yīng)都會(huì)一定程度上導(dǎo)致胃黏膜增生，但NF－κB2對(duì)胃黏膜的影響程度要大于NF－κB1［4］。當(dāng)前的研究已經(jīng)基本定義了NF－κB1／2基因的起源，也明確了 NF－κB家族在脊椎動(dòng)物中的功能差異，但對(duì)造成這些差異的原因還沒(méi)有明確的定義。不過(guò)可以推斷，NF－κB1／2的 RHD、IPT、ANK 與 DD 在 NF－κB1與 NF－κB2基因亞家族分子進(jìn)化特征的形成和分子功能分歧的產(chǎn)生方面扮演了重要的角色。

本研究選擇模式脊椎動(dòng)物的NF－κB1／2基因與蛋白質(zhì)序列，針對(duì)NF－κB1／2的RHD、IPT、ANK和DD 4個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在揭示引起NF－κB1／2功能分化的部分原因，并闡述 NF－κB1／2在脊椎動(dòng)物中進(jìn)化、變遷的基本趨勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)的收集與下載

序列比對(duì)與核苷酸替代率分析所用的NF－κB1／2氨基酸、核苷酸序列均下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）。序列比對(duì)使用了包括人類(lèi)（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、原雞（gallus gallus）、非洲爪蟾（Xenopus（Silurana）tropicalis）、美國(guó)短吻鱷 （Alligator mississippiensis）、二 色熱帶魚(yú)（Stegastes partitus）7種具有代表性的模式動(dòng)物的NF－κB1／2的氨基酸序列。而核苷酸替代率分析則選用了魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和海陸哺乳類(lèi)共計(jì)20余種脊椎動(dòng)物的 NF－κB1／2核苷酸序列［10］。

1.2 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

使用ClustalW將下載序列對(duì)齊，使用DAMBE等軟件進(jìn)行格式處理，得到的結(jié)果輸入MEGA 6.0軟件，使用鄰接法（Neighbor－Joining，NJ），經(jīng)過(guò)自展法（Bootstrap）1000次重復(fù)驗(yàn)證，以保證樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的可靠性，分別構(gòu)建NF－κB1／2氨基酸全序列及其各個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［11－12］。

1.3 NF－κB1／2蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

使用Pfam 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http:／／pfam.sanger.ac.uk／）對(duì) NF－κB1／2蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.4 進(jìn)化速率計(jì)算檢驗(yàn)與分析

使用DAMBE等軟件處理序列文本格式，使用MEGA6.0，ClustalW 進(jìn)行向?qū)?shù)的構(gòu)建［13］。將處理結(jié)果文件輸入paml軟件包，codeml工具［14－15］，分別選取模型A:所有的分支有一個(gè)ω，模型B:所有的分支有相同的ω且等于1，模型H:每一支都有自己的ω，選擇最優(yōu)模型從而得出各個(gè)結(jié)構(gòu)域的整體ω值。每個(gè)位點(diǎn)ω的計(jì)算也使用codeml工具，NS－site參數(shù)為0、1、2、7、8，在生成結(jié)果中優(yōu)先選用BEB模型，從而得到 NF－κB1／2的 RHD、ANK 和DD 中各個(gè)位點(diǎn)的 ω值［16－17］。

2 結(jié) 果

2.1 基于 NF－κB1／2與結(jié)構(gòu)域 RHD、IPT、ANK和DD氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

如圖1a所示，進(jìn)化樹(shù)中 NF－κB1／2分為兩大支，進(jìn)化趨勢(shì)與物種進(jìn)化趨勢(shì)一致。由魚(yú)類(lèi)至兩棲類(lèi)之后，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)再分為兩支，其中一支為爬行類(lèi)與鳥(niǎo)類(lèi)，另一支為哺乳類(lèi)。樹(shù)中NF－κB1／2兩個(gè)成員在整個(gè)脊椎動(dòng)物進(jìn)化歷程中并沒(méi)有出現(xiàn)任何的交織，這表明NF－κB基因家族早在脊椎動(dòng)物與非脊椎動(dòng)物分歧時(shí)，就已經(jīng)分化成為 NF－κB1和 NF－κB2，然后開(kāi)始獨(dú)立進(jìn)化。

圖1 NF－κB1／2氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Phylogenetic tree of NF－κB1／2and their conserved domains

脊椎動(dòng)物 NF－κB1／2兩個(gè)成員都包含 RHD、ANK、IPT和DD 4個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖1b），由它們的氨基酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）與基于全序列構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)基本一致。

2.2 基于 NF－κB1／2 結(jié)構(gòu)域（RND、IPT、ANK 和DD）的序列分析

圖3中，NF－κB1／2之間在RHD上存在較多保守區(qū)域，但在序列的60～66、108～117、157～164位氨基酸區(qū)段（圖中方框標(biāo)出）也發(fā)現(xiàn)了它們各自的特征序列。在IPT區(qū)域上，兩個(gè)基因在相應(yīng)物種間都表現(xiàn)出較高的同源性。而在ANK區(qū)域上，無(wú)論在直系同源還是旁系同源結(jié)構(gòu)中，該區(qū)域都出現(xiàn)了較大差異。另外，相對(duì)于其他3個(gè)結(jié)構(gòu)域，DD區(qū)域的旁系同源結(jié)構(gòu)之間存在很大的差異，而直系同源結(jié)構(gòu)則表現(xiàn)出較高的同源性。

2.3 NF－κB1／2各保守結(jié)構(gòu)域選擇壓力比較

Codeml中各模型比對(duì)結(jié)果顯示，NF－κB1的ANK、RHD和 DD，NF－κB2的 ANK 與 RHD都更適用于H模型，檢測(cè)結(jié)果為極顯著；而NF－κB1／2的IPT，NF－κB2的DD更適用于A模型，檢測(cè)結(jié)果也極顯著。

分別比較了 NF－κB1／2的 RHD、ANK、IPT與DD區(qū)域的選擇壓力，結(jié)果（表1）表明，在魚(yú)類(lèi)及兩棲動(dòng)物上，NF－κB1／2的 RHD，NF－κB1的 ANK 顯示出較高的ω值；在爬行動(dòng)物與鳥(niǎo)類(lèi)上，NF－κB1／2的ANK與NF－κB1的DDω值較大；而在哺乳動(dòng)物中，大多數(shù)結(jié)構(gòu)域的ω值均低于0.1。

而對(duì)NF－κB1／2氨基酸各位點(diǎn)選擇壓力（圖4）分析表明，RHD、IPT、ANK與DD序列的ω值均小于1.2，且在所分析脊椎動(dòng)物中，4個(gè)結(jié)構(gòu)域均沒(méi)有出現(xiàn)處于顯著水平的正選擇位點(diǎn)。NF－κB1／2的RHD區(qū)域大多數(shù)位點(diǎn)ω值在0.1以下。相對(duì)于RHD、IPT與DD區(qū)域，ANK區(qū)域則擁有較高的進(jìn)化速率；NF－κB1的IPT絕大多數(shù)位點(diǎn)ω值較低，而NF－κB2的IPT所有位點(diǎn)的ω值均在0.01以下；NF－κB1／2的DDω曲線存在較大差異，NF－κB1的DD各個(gè)位點(diǎn)的ω值顯示出較大的波動(dòng)。

3 討 論

NF－κB1／2屬于 NF－κB基因家族中的亞家族，作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導(dǎo)機(jī)體多種正向調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，在動(dòng)物機(jī)體免疫反應(yīng)、骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮重要作用［1］。研究表明，NF－κB基因的原始結(jié)構(gòu)起源于后生動(dòng)物以前，在進(jìn)化過(guò)程中分化為NF－κB 1和NF－κB2［6］。通過(guò)構(gòu)建NF－κB1／2 的進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)NF－κB基因家族早在脊椎動(dòng)物與非脊椎動(dòng)物發(fā)生分歧前，就已經(jīng)分化成為 NF－κB1和 NF－κB2，然后開(kāi)始獨(dú)立進(jìn)化，這與其他報(bào)道［18］得出的結(jié)論一致。

圖2 NF－κB1／24個(gè)結(jié)構(gòu)域RHD、IPT、ANK與DD氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic trees of RHD，IPT，ANK and DD of NF－κB1／2based on their amino acid sequences

表1 NF－κB1／2基因各結(jié)構(gòu)域在脊椎動(dòng)物各個(gè)群類(lèi)中的ω均值Table 1 The average value ofωof domains of NF－κB1／2genes in different vertebrate groups

圖3 NF－κB1／2的RHD、IPT、ANK和DD保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域比對(duì)Fig.3 Alignment of RHD，IPT，ANK and DD conserved domains of NF－κB1／2

圖4 NF－κB1／2RHD、IPT、ANK與DD結(jié)構(gòu)域各位點(diǎn)選擇壓力Fig.4 The selection pressure of RHD，IPT，ANK and DD conserved domains of NF－κB1／2

RHD、IPT、ANK 與 DD 是 NF－κB1／2亞家族成員重要的典型結(jié)構(gòu)域，早在兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物時(shí)期4個(gè)結(jié)構(gòu)域就已經(jīng)形成［8］，且這樣的序列結(jié)構(gòu)一直持續(xù)到了哺乳動(dòng)物［8，18］?？梢酝茢?，RHD、IPT、ANK與DD在NF－κB1與NF－κB2基因亞家族分子進(jìn)化特征的形成和分子功能分歧的產(chǎn)生方面扮演了重要的角色。本研究構(gòu)建了各個(gè)結(jié)構(gòu)域氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)由它們的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與基于全序列構(gòu)建的發(fā)育樹(shù)形態(tài)基本相同，說(shuō)明NF－κB1和 NF－κB2分歧后，NF－κB1和 NF－κB2各個(gè)結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化趨勢(shì)與其整體序列基本一致。

選擇壓力分析能使人們對(duì)NF－κB1／2在進(jìn)化中所受到的環(huán)境阻力與其序列位點(diǎn)的變異情況有更深入的認(rèn)識(shí)。因此，為了更進(jìn)一步探索NF－κB1／2在脊椎動(dòng)物階段的進(jìn)化歷程，筆者又分別分析了NF－κB1／2各個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同動(dòng)物類(lèi)群中（魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳動(dòng)物）的選擇壓力，發(fā)現(xiàn)不同種類(lèi)動(dòng)物NF－κB1／2保守結(jié)構(gòu)域 ω值存在差異，說(shuō)明 NF－κB1／2各個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同的進(jìn)化階段存在著明顯不同的進(jìn)化歷程。而在對(duì)NF－κB1／2各個(gè)結(jié)構(gòu)域序列位點(diǎn)的分析中，發(fā)現(xiàn)NF－κB1／2整體序列相對(duì)保守，不存在顯著的正選擇位點(diǎn)。不過(guò)NF－κB2的DD所承受的選擇壓力卻明顯大于NF－κB1的DD，這很可能是由于NF－κB2的DD所含有的水解抑制區(qū)（Processing inhibitory domain，PID）在生理過(guò)程中的重要作用所導(dǎo)致［19］。

另外，對(duì)脊椎動(dòng)物 NF－κB1／2 的 RHD、IPT、ANK和DD與直系、旁系同源結(jié)構(gòu)的同源性分析顯示，NF－κB1／2的序列發(fā)生了各自獨(dú)立的進(jìn)化，且這樣的獨(dú)立進(jìn)化在RHD中表現(xiàn)的尤為顯著，暗示NF－κB1／2在功能上的分工越來(lái)越明確。而IPT表現(xiàn)的高保守性與它在生理過(guò)程中的重要功能相吻合［5，20］。ANK相對(duì)于其他3個(gè)結(jié)構(gòu)域在脊椎動(dòng)物的NF－κB1／2間擁有顯著的差異，推測(cè)它可能是導(dǎo)致NF－κB1／2在脊椎動(dòng)物階段序列、功能差異形成的重要因素。而DD僅在NF－κB1／2之間存在較大的差異，且這樣的差異在魚(yú)類(lèi)中就已經(jīng)表現(xiàn)出來(lái)了，這不僅說(shuō)明了它在脊椎動(dòng)物階段中的保守性，也暗示了NF－κB1／2的DD分歧的年代較為久遠(yuǎn)，甚至可能與NF－κB1／2基因的分歧有一定關(guān)聯(lián)，但是因?yàn)镹F－κB1／2的分化早于脊椎動(dòng)物而晚于兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物，期間相關(guān)的動(dòng)物序列素材較少，因此人們無(wú)法進(jìn)行確切的論證。

綜上，在脊椎動(dòng)物的各個(gè)類(lèi)群中，NF－κB1／2承受著不同的選擇壓力，它們的4個(gè)結(jié)構(gòu)域也表現(xiàn)出了不同的變異程度與特點(diǎn)。NF－κB1／2在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化與功能分歧主要由ANK的序列變異造成，而NF－κB1／2在脊椎動(dòng)物之前的分歧很可能與DD有著密切的聯(lián)系。

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