韓玉婕，呼世斌，賈 嬋，張春慧，王效國(guó)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸研究

韓玉婕，呼世斌，賈 嬋，張春慧，王效國(guó)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究利用米根霉(Rhizopusoryzae)As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的最佳條件，為小麥淀粉廢水資源化利用提供參考?！痉椒ā?以米根霉As3.866為供試菌種，以小麥淀粉廢水為發(fā)酵培養(yǎng)基直接發(fā)酵生產(chǎn)L(+)-乳酸，通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，依次研究米根霉種齡、接種量、裝液量、轉(zhuǎn)速、溫度、pH、中和劑種類、CaCO3添加量及添加時(shí)間對(duì)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度以及米根霉菌絲體生物量和生長(zhǎng)狀況的影響，確定最佳發(fā)酵條件，并在此基礎(chǔ)上考察發(fā)酵后廢水中COD的去除效果。【結(jié)果】 得到利用米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水的最佳發(fā)酵條件：米根霉種齡為18 h，接種量為10%，裝液量為20%，溫度為26 ℃，pH為5.5，轉(zhuǎn)速為170 r/min，發(fā)酵8 h后添加10 g/L的CaCO3，發(fā)酵周期為52 h?！窘Y(jié)論】 獲得了利用米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的最佳發(fā)酵條件，在該條件下，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度可達(dá)15.28 g/L，廢水中COD的去除率達(dá)85%。

L(+)-乳酸；米根霉；小麥淀粉廢水；發(fā)酵條件

淀粉加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量高濃度酸性有機(jī)廢水，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，但該類廢水中含有大量殘余淀粉、蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、纖維素、灰分等有機(jī)物質(zhì)[1]，這就為此類廢水的資源化利用提供了可能。目前，淀粉廢水的資源化利用主要包括發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)[2]、回收蛋白[3]以及生產(chǎn)新能源3方面，其中用淀粉廢水生產(chǎn)新能源包括產(chǎn)沼氣[4]、生物制氫[5-6]、發(fā)酵產(chǎn)乳酸[7-8]等。乳酸是一種重要的多用途有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、制藥、飼料、農(nóng)藥、日用化工、皮革和紡織等行業(yè)[9]，近年來其最主要的用途之一是以L(+)-乳酸為原料合成高功能性生物降解材料——聚乳酸(PLA)[10]。我國(guó)以發(fā)酵法生產(chǎn)L(+)-乳酸選取的原料主要為玉米、馬鈴薯、木薯、甘薯、大米淀粉[11]。近年來，結(jié)合環(huán)境保護(hù)，國(guó)內(nèi)外開展了以有機(jī)廢棄物為原料生產(chǎn)乳酸的研究，常用的有機(jī)廢棄物有食品加工廢棄物、餐廚垃圾[12]、木頭、秸稈水解液[13]等。但在此過程中淀粉質(zhì)原料的高溫糊化、液化、糖化單元耗能巨大，且纖維質(zhì)原料的水解需消耗大量硫酸和昂貴纖維素酶，增加了生產(chǎn)成本和工序，同時(shí)會(huì)造成環(huán)境污染。如能利用米根霉的糖化能力直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)乳酸，省去淀粉液化和糖化的處理過程，則可節(jié)省能源，且工序簡(jiǎn)單、成本低廉，在降低環(huán)境污染的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)淀粉廢水的資源化利用，但目前此方面的研究尚鮮見報(bào)道[7-8]。本研究以小麥淀粉廢水作為微生物生長(zhǎng)的碳源，輔以其他氮源生產(chǎn)乳酸，研究利用米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的工藝，探索最佳發(fā)酵條件，旨在為利用小麥淀粉廢水直接發(fā)酵生產(chǎn)L(+)-乳酸的中試及工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)行前期技術(shù)探索，為小麥淀粉廢水的資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

米根霉As3.866，購于上海通派生物科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 綜合馬鈴薯培養(yǎng)基 取200 g/L馬鈴薯汁1 L，分別加入葡萄糖20 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 0.75 g、硫胺素8 mg、瓊脂20 g。115 ℃滅菌20 min。其中，硫胺素按量配制成母液，滅菌后，經(jīng)孔徑0.45 μm的濾器過濾后加入培養(yǎng)基中。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 可溶性淀粉10 g/L，葡萄糖60 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO40.35 g/L，MgSO4·7H2O 0.26 g/L，ZnSO40.12 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 以添加0.5 g/L硫酸銨的小麥淀粉廢水原水為發(fā)酵培養(yǎng)基， 115 ℃滅菌20 min。小麥淀粉廢水取自陜西眉縣營(yíng)頭鎮(zhèn)某淀粉生產(chǎn)車間各段工藝所產(chǎn)生的廢水，其pH值在3.78～4.94，其他水質(zhì)特征如表1所示。

表1 小麥淀粉廢水的特征Table 1 Characteristics of wheat starch wastewater

1.3 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：將米根霉As3.866菌種接種于綜合馬鈴薯培養(yǎng)基上，25～28 ℃培養(yǎng)5～7 d，置于4 ℃冰箱保藏，每隔1月傳代1次。

種子培養(yǎng)：取已制備好的米根霉孢子懸液(孢子密度為1×105mL-1)1 mL接種于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30 ℃下?lián)u床(150 r/min)培養(yǎng)24 h，得到小菌球。

1.4 米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

研究不同米根霉種齡、接種量、裝液量和轉(zhuǎn)速、溫度、pH、中和劑種類、CaCO3添加量及添加時(shí)間9個(gè)因素對(duì)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量和菌絲體生長(zhǎng)狀況的影響，確定最佳發(fā)酵條件，其中每個(gè)因素是在確定前面優(yōu)化因素水平的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。

1.4.1 米根霉種齡的確定 在接種量為5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)、裝液量為10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)、轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為26 ℃、pH為4.0、發(fā)酵12 h后加入10 g/L CaCO3(單獨(dú)滅菌，下同)的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定米根霉種齡分別為14,16，18，20，22，24 h時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度的變化。

1.4.2 接種量的確定 在米根霉種齡為18 h、裝液量為10%、轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為26 ℃、pH為4.0、發(fā)酵12 h后加入10 g/L CaCO3的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定接種量分別為2%，5%，10%，15%，20%時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量的變化，觀測(cè)米根霉菌絲體的生長(zhǎng)狀況。

1.4.3 裝液量的確定 在米根霉種齡為18 h、接種量為10%、轉(zhuǎn)速為150 r/min、溫度為26 ℃、pH為4.0、發(fā)酵12 h后加入10 g/L CaCO3的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定裝液量分別為10%，20%，30%，40%，50%時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量的變化，觀測(cè)米根霉菌絲體的生長(zhǎng)狀況。

1.4.4 搖床轉(zhuǎn)速的確定 在米根霉種齡為18 h、接種量為10%、裝液量為20%、溫度為26 ℃、pH為4.0、發(fā)酵12 h后加入10 g/L CaCO3的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定搖床轉(zhuǎn)速分別為130，150，170，190，210 r/min時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量的變化，觀測(cè)米根霉菌絲體的生長(zhǎng)狀況。

1.4.5 培養(yǎng)溫度的確定 在米根霉種齡為18 h、接種量為10%、裝液量為20%、轉(zhuǎn)速為170 r/min、pH為4.0、發(fā)酵12 h后加入10 g/L CaCO3的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定培養(yǎng)溫度分別為22，26，30，34 ℃時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量的變化。

1.4.6 pH的確定 在米根霉種齡為18 h、接種量為10%、裝液量為20%、轉(zhuǎn)速為170 r/min、溫度為26 ℃、發(fā)酵12 h后加入10 g/L CaCO3的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定 pH分別為3.5，4.5，5.5，6.5時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量的變化。

1.4.7 中和劑的確定 在米根霉種齡為18 h、接種量為10%、裝液量為20%、轉(zhuǎn)速為170 r/min、溫度為26 ℃、pH為5.5、發(fā)酵12 h后加入中和劑條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定中和劑分別為CaCO3，NH3·H2O，NaOH，NaHCO3時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度的變化，觀測(cè)米根霉菌絲體的生長(zhǎng)狀況。

1.4.8 CaCO3添加量的確定 在米根霉種齡為18 h、接種量為10%、裝液量為20%、轉(zhuǎn)速為170 r/min、溫度為26 ℃、pH為5.5、發(fā)酵12 h后加入CaCO3的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h(期間不調(diào)節(jié)pH)，測(cè)定CaCO3添加量分別為5，10，20，30，40 g/L時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量的變化。試驗(yàn)以未添加CaCO3處理為對(duì)照組(CK)。

1.4.9 CaCO3添加時(shí)間的確定 在米根霉種齡為18 h、接種量為10%、裝液量為20%、轉(zhuǎn)速為170 r/min、溫度為26 ℃、pH為5.5、加入10 g/L CaCO3的條件下，恒溫培養(yǎng)42 h，測(cè)定CaCO3添加時(shí)間分別為0，4，8，12，16，20 h時(shí)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度及米根霉菌絲體生物量的變化，觀測(cè)米根霉菌絲體的生長(zhǎng)狀況。

1.5 米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸后COD去除效果的考察

在最佳發(fā)酵條件下，利用米根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)量濃度為24.2 g/L、COD濃度為10 532 mg/L的小麥淀粉廢水，發(fā)酵72 h，每隔4 h取樣1次，測(cè)定L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和COD值，考察米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸后廢水中COD的去除情況。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.6.1 米根霉菌絲體生物量 用體積分?jǐn)?shù)10%的鹽酸充分洗滌菌體，除去殘留的碳酸鈣，再用蒸餾水洗滌數(shù)次，于80 ℃烘干至質(zhì)量恒定后稱量，計(jì)算米根霉菌絲體生物量[14]。

1.6.2 L(+)-乳酸質(zhì)量濃度 發(fā)酵液經(jīng)稀釋后，采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定乳酸質(zhì)量濃度。采用Waters515高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，色譜柱為迪馬公司的C18反相柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.01 mol/L的磷酸氫二銨溶液(磷酸調(diào)pH至2.7)流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫為室溫，信噪比為3[15]。

1.6.3 COD及COD去除率 COD的測(cè)定采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[16]進(jìn)行。

COD去除率=[發(fā)酵前小麥淀粉廢水中的COD值-發(fā)酵后小麥淀粉廢水中的COD值]/發(fā)酵前小麥淀粉廢水中的COD值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 米根霉種齡 種子培養(yǎng)的目的是使生物量增大，如果種齡過短，則菌體密度低，會(huì)使發(fā)酵前滯期增長(zhǎng)；種齡過長(zhǎng)，菌體老化，酶活力降低，也會(huì)使發(fā)酵周期延長(zhǎng)。將已制備好的米根霉孢子懸液(密度為1×105mL-1)1 mL接種于種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，30 ℃下培養(yǎng)40 h，每隔2 h取樣測(cè)定發(fā)酵液pH及米根霉菌絲體生物量，結(jié)果見圖1。

圖1 米根霉As3.866種子生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of R.oryzae As3.866 seed

由圖1可以看出，在米根霉As3.866孢子增殖過程中，pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，培養(yǎng)0～14 h，pH值迅速由5.12下降為2.02，14 h后pH逐步穩(wěn)定；米根酶菌絲體的生物量逐漸增加，培養(yǎng)0～14 h為菌體生長(zhǎng)延滯期，生物量增加不明顯，10～24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，米根霉菌絲體生物量迅速增加，24 h后米根霉菌絲體生物量趨于穩(wěn)定，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。一般而言，處于分裂旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的菌種繁殖能力強(qiáng)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基后能很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，有利于縮短發(fā)酵周期和提高產(chǎn)酸率。所以本研究選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期14，16，18，20，22，24 h的種子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵42 h后測(cè)定L(+)-乳酸質(zhì)量濃度，研究不同種齡對(duì)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，隨著種齡的增加，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度逐漸增加，至種齡為18 h時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著種齡的繼續(xù)增加，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度下降，故后續(xù)試驗(yàn)中，米根霉As3.866種齡選定為18 h，即采用培養(yǎng)18 h的米根霉種子液接種最好。

圖2 種齡對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effects of seed age on L(+)-lactic acid concentration during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

2.1.2 接種量 為了考察接種量對(duì)發(fā)酵的影響，取培養(yǎng)18 h的米根霉種子液，按不同接種量(2%，5%，10%，15%，20%)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵42 h后測(cè)定發(fā)酵液中的L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量，觀察米根霉菌絲體的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如表2所示。

表2 接種量對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和菌絲體生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of seed culturing amount on L(+)-lactic acid concentration and mycelial growth of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

由表2可以看出，米根霉As3.866接種量對(duì)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量和生長(zhǎng)狀況影響較大，其中L(+)-乳酸質(zhì)量濃度隨著接種量的增加而呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)；米根霉菌絲體生物量隨著接種量的增加沒有明顯的變化規(guī)律，米根霉菌絲體生長(zhǎng)狀況隨著接種量的增加有所不同。當(dāng)接種量為2%時(shí)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，接入的米根霉菌球不能維持球狀，并不斷團(tuán)聚新形成的菌絲體而相互纏繞形成絮狀團(tuán)塊；當(dāng)接種量為5%時(shí)，形成直徑為0.3～1.5 mm的菌球，但含有少量絮狀團(tuán)塊；當(dāng)接種量為10%時(shí)，形成直徑為1～2 mm的菌球，此時(shí)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度最大，為12.24 g/L；當(dāng)接種量為15%時(shí)，雖然可以形成均一菌球，但L(+)-乳酸質(zhì)量濃度略有降低；當(dāng)接種量為20%時(shí)，形成大塊絮狀團(tuán)塊，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度也明顯降低。接種量過低或過高，接入的米根霉菌球均會(huì)形成大塊絮狀團(tuán)塊，米根霉菌絲體的生物量較高，但不利于L(+)-乳酸的生成。米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉生產(chǎn)L(+)-乳酸的最佳接種量為10%。

2.1.3 裝液量 發(fā)酵過程中的溶氧情況對(duì)米根霉菌絲體生長(zhǎng)和L(+)-乳酸的積累影響較大。在生產(chǎn)L(+)-乳酸的前期，菌絲體生長(zhǎng)以好氧為主，后期產(chǎn)酸階段以厭氧為主。搖瓶發(fā)酵過程中裝液量影響著培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧含量，從而影響著米根霉的生長(zhǎng)和L(+)-乳酸的積累。一定范圍內(nèi)，裝液量越低，溶解氧含量越高，L(+)-乳酸積累越多，但如果裝液量過低，菌絲體以菌絲的形態(tài)存在，并不利于L(+)-乳酸的積累，如果裝液量過高，氧的傳輸受阻，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度也會(huì)隨之降低。裝液量對(duì)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量的影響如表3所示。

表3 裝液量對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和菌絲體生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of working volume on L(+)-lactic acid concentration and mycelial growth of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

表3顯示，當(dāng)裝液量為10%時(shí)，米根霉菌絲體生物量為3.34 g/L，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度較低，為7.42 g/L，菌絲體以菌絲的形態(tài)存在；當(dāng)裝液量為20%～50%時(shí)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度變化明顯，為8.47～13.73 g/L，米根霉菌絲體生物量變化不明顯，為2.98～3.78 g/L，菌絲體大部分以菌球形式存在，其中當(dāng)裝液量為20%時(shí)，獲得的L(+)-乳酸質(zhì)量濃度最大，為13.73 g/L，菌絲體大部分以菌球形式存在。由以上分析可知，米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉生產(chǎn)L(+)-乳酸的最佳裝液量為20%。

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速 三角瓶中的發(fā)酵液在搖床上震蕩培養(yǎng)，可使氣液混合和分散，使得空氣中的氧有效溶解。但轉(zhuǎn)速不僅通過影響溶氧對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生影響，同時(shí)也是影響米根霉成球效果的重要因素。轉(zhuǎn)速對(duì)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和生物量的影響如表4所示。

表4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和菌絲體生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of agitation speed on L(+)-lactic acid concentration and mycelial growth of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

表4顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)速為130 r/min時(shí)，米根霉菌絲體為菌絲或絮狀團(tuán)塊，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度較低，為6.42 g/L；當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，米根霉菌絲體為菌球，且含有少量菌絲，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度為11.21 g/L；當(dāng)轉(zhuǎn)速為170 r/min時(shí)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量均達(dá)最大；之后隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增加，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量均降低，且菌絲體不能維持球形。米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉生產(chǎn)L(+)-乳酸的最佳轉(zhuǎn)速為170 r/min。

2.1.5 溫 度 一般而言，微生物的最適生長(zhǎng)溫度和微生物代謝合成產(chǎn)物的最適溫度并不一致，本研究所用米根霉的最適生長(zhǎng)溫度為25～28 ℃，故選定22，26，30和34 ℃，研究溫度對(duì)米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的影響，結(jié)果如表5所示。由表5可知，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和菌絲體生物量受溫度影響明顯，當(dāng)溫度為26 ℃時(shí)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量均達(dá)到最大值，故最佳溫度為26 ℃。

2.1.6 pH 環(huán)境pH值對(duì)微生物的生命活動(dòng)影響很大，pH值的變化會(huì)影響酶活性以及菌體對(duì)基質(zhì)的利用速率和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而影響菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的形成。小麥淀粉廢水發(fā)酵生產(chǎn)L(+)-乳酸是產(chǎn)酸過程，pH值會(huì)逐步降低，這對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和乳酸的累積都有很強(qiáng)的抑制作用。試驗(yàn)中，每隔4 h添加1次4 mol/L的氫氧化鈉溶液，控制發(fā)酵液的pH分別為3.5，4.5，5.5和6.5，以L(+)-乳酸質(zhì)量濃度、米根霉菌絲體生物量為考察指標(biāo)，研究小麥淀粉廢水發(fā)酵生產(chǎn)L(+)-乳酸的最適pH，結(jié)果見表6。

表5 溫度對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和菌絲體生物量的影響Table 5 Effects of temperature on L(+)-lactic acid concentration and mycelial biomass of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater R.oryzae As3.866

表6 pH對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和菌絲體生物量的影響Table 6 Effects of pH on L(+)-lactic acid concentration and mycelial biomass of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

表6顯示，當(dāng)pH為3.5～6.5時(shí)，隨著pH的升高，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量均先升高后降低，當(dāng)pH為5.5時(shí)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度達(dá)最大，米根霉菌絲體生物量也較高，故米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉生產(chǎn)L(+)-乳酸的最適pH為5.5。

2.1.7 中和劑 添加不同種類的中和劑可以為乳酸發(fā)酵微生物生長(zhǎng)提供所需的最佳pH及獲得利于產(chǎn)酸的菌體形態(tài)和獲得更大的乳酸積累[17]。不同中和劑對(duì)米根霉菌絲體生長(zhǎng)狀況的影響如圖3所示，對(duì)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度的影響如表7所示。

圖3 中和劑對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸過程中菌絲體生長(zhǎng)的影響a.CaCO3;b.NH3·H2O;c.NaOH;d.NaHCO3Fig.3 Effects of neutralizing agent on mycelial growth of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

表7 中和劑對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度的影響Table 7 Effects of neutralizing agent on L(+)-lactic acid concentration during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

圖3和表7顯示，以CaCO3為中和劑時(shí)，米根霉菌絲體形態(tài)為菌球，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度最高，達(dá)13.48 g/L；以NH3·H2O為中和劑時(shí)，米根霉菌絲體形態(tài)為稍微蓬松的菌絲絮狀體，夾雜短桿狀菌體，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度最低，為7.32 g/L；以NaOH為中和劑時(shí)，米根霉菌絲體形態(tài)為棉絮狀，相互纏繞在一起，發(fā)酵液的黏度增加，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度也較低；以NaHCO3為中和劑時(shí)，米根霉菌絲體形態(tài)為菌球，但菌球分布不均一，且夾雜分散的菌絲體，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度較高。由以上結(jié)果可知，米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉生產(chǎn)L(+)-乳酸的最佳中和劑為CaCO3。

2.1.8 CaCO3添加量 本研究分別將5，10，20，30，40 g/L的CaCO3粉末添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，以未添加CaCO3處理為對(duì)照組(CK)，且在發(fā)酵過程中未調(diào)節(jié)pH值，發(fā)酵42 h后測(cè)定L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量，結(jié)果見表8。

表8 CaCO3添加量對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和菌絲體生物量的影響Table 8 Effects of CaCO3 addition amount on L(+)-lactic acid concentration and mycelial biomass of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

由表8可知，與CK相比，當(dāng)CaCO3添加量為10 g/L時(shí)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量均達(dá)最大。當(dāng)CaCO3添加量大于10 g/L時(shí)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生物量均略有下降。因此，米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸時(shí)CaCO3的最佳添加量為10 g/L。

2.1.9 CaCO3添加時(shí)間 分別選擇發(fā)酵開始后的0，4，8，12，16，20 h添加10 g/L 的CaCO3，研究CaCO3添加時(shí)間對(duì)米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的影響，結(jié)果如表9所示。

表9 CaCO3添加時(shí)間對(duì)米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸質(zhì)量濃度和米根霉菌絲體生長(zhǎng)的影響Table 9 Effects of CaCO3 addition time on L(+)-lactic acid concentration and mycelial growth of R.oryzae during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

表9顯示，在發(fā)酵開始后的第8 h添加CaCO3，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度最高，達(dá)15.85 g/L；在發(fā)酵開始后的第12，16，20 h添加CaCO3，米根霉菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌絲體生長(zhǎng)迅速，菌絲容易包裹新添加的CaCO3，形成菌塊，不利于后期產(chǎn)酸，故L(+)-乳酸質(zhì)量濃度降低。由以上分析可知，發(fā)酵開始后的第8 h加入CaCO3能夠得到較好的發(fā)酵效果。這與Wu等[18]利用半連續(xù)發(fā)酵法生產(chǎn)L(+)-乳酸時(shí)的最佳CaCO3添加時(shí)間一致。

2.2 米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸后對(duì)COD的去除效果

圖4顯示，在最初的16 h內(nèi)，L(+)-乳酸質(zhì)量濃度無明顯增加，之后L(+)-乳酸質(zhì)量濃度迅速增加，至52 h時(shí)達(dá)15.28 g/L，然后趨于穩(wěn)定，因此，米根霉直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的發(fā)酵周期為52 h。在0～52 h時(shí)，隨著發(fā)酵產(chǎn)酸的進(jìn)行，小麥淀粉廢水中的碳源物質(zhì)被米根霉的生長(zhǎng)所利用，COD的去除率隨之增加，52 h后COD去除率的增幅減小。發(fā)酵至72 h時(shí)，廢水中的COD值降為1 532 mg/L，去除率達(dá)85%。

圖4 米根霉As3.866直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸的質(zhì)量濃度和廢水中COD去除率的變化Fig.4 Variations of removal efficient of COD and L (+)-lactic acid concentration during direct fermentation of wheat starch wastewater by R.oryzae As3.866

3 結(jié) 論

利用米根霉AS3.866可直接發(fā)酵小麥淀粉廢水生產(chǎn)L(+)-乳酸，其最佳發(fā)酵條件為：米根霉種齡為18 h，接種量為10%，裝液量為20%，轉(zhuǎn)速為170 r/min，溫度為26 ℃，pH為5.5，發(fā)酵8 h后添加10 g/L的CaCO3，發(fā)酵周期為52 h，在該條件下L(+)-乳酸質(zhì)量濃度可達(dá)15.28 g/L，廢水中COD的去除率可達(dá)85%。

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Direct fermentation of wheat starch wastewater to produce L(+)-lactic acid byRhizopusoryzae

HAN Yu-jie,HU Shi-bin,JIA Chan,ZHANG Chun-hui,WANG Xiao-guo

(CollegeofNaturalResourceandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This research studied the optimal fermentation conditions for direct fermentation of wheat starch wastewater to produce L(+)-lactic acid byRhizopusoryzae.This would provide reference for utilization of wheat starch wastewater resource.【Method】RhizopusoryzaeAs3.866 was selected to produce L(+)-lactic acid using starch wastewater as fermentation medium.By liquid flask fermentation,effects of seed age,seed culturing amount,working volume,agitation speed,temperature,pH value,neutralizing agent,as well as amount and time of CaCO3addition on concentration and biomass of L(+)-lactic acid were studied.Then the optimum fermentation conditions were determined and COD removal efficiency in wastewater was evaluated.【Result】 The optimum fermentation conditions of flask fermentation were:seed age ofR.oryzae18 h,seed culturing amount 10%,working volume 20%,pH 5.5,agitation speed 170 r/min,addition of 10 g/L CaCO3after 8 h,and fermentation period 52 hours.【Conclusion】 Under the obtained optimum fermentation conditions,the concentration of L(+)-lactic acid produced byR.arrhizusAs3.866 was 15.28 g/L and removal efficiency of COD reached 85%.

L(+)-lactic acid;Rhizopusoryzae;wheat starch wastewater;ferment conditions

2013-12-13

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101404)

韓玉婕(1988-)，女(蒙古族)，內(nèi)蒙古通遼人，在讀碩士，主要從事廢水處理與資源清潔利用研究。 E-mail:bluesky880203@163.com

呼世斌(1955-)，男，陜西延安人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事廢水處理與資源清潔利用研究。 E-mail:1326801980@qq.com

時(shí)間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.011

X792

A

1671-9387(2015)04-0149-08

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