樊瑾瑛，應(yīng)瓊瓊，黨 亮，奚耕思

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物生殖與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710062)

擬黑多刺蟻hsp90基因的RNA干擾及其對(duì)EcR和USP基因mRNA表達(dá)的影響

樊瑾瑛，應(yīng)瓊瓊，黨 亮，奚耕思

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物生殖與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710062)

【目的】 對(duì)擬黑多刺蟻(PolyrhachisvicinaRoger)成蟲熱激蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)基因進(jìn)行RNA干擾(RNAi)，為分析hsp90基因的功能及將RNAi技術(shù)用于害蟲防治提供參考?！痉椒ā?采用Trizol法提取擬黑多刺蟻總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈用于hsp90基因的克隆。利用 T7 RiboMAXTMExpress RNAi System將hsp90合成雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，將其配制成120，60，30，15和7.5 ng/μL的溶液飼喂擬黑多刺蟻雌蟻、雄蟻和工蟻成蟲進(jìn)行RNAi，共飼喂14 d，記錄成蟲死亡率，確定dsRNA最適質(zhì)量濃度，并以此劑量對(duì)各品級(jí)成蟲進(jìn)行干擾，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)干擾效果及干擾hsp90基因?qū)cR、USPmRNA表達(dá)的影響?！窘Y(jié)果】 成功獲得擬黑多刺蟻hsp90基因片段，其長(zhǎng)度523 bp，并合成了dsRNA。飼喂dsRNA后發(fā)現(xiàn)，dsRNA質(zhì)量濃度越大， 擬黑多刺蟻死亡率越高，在dsRNA質(zhì)量濃度為120 ng/μL時(shí)，飼喂5 d后成蟲全部死亡；30 ng/μL是dsRNA干擾的最適質(zhì)量濃度。以30 ng/μL dsRNA干擾后，熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，擬黑多刺蟻每個(gè)品級(jí)成蟲hsp90基因mRNA均被沉默。hsp90基因被干擾后，EcR的表達(dá)沒(méi)有顯著變化，USP的表達(dá)顯著降低?！窘Y(jié)論】 采用飼喂法成功干擾了擬黑多刺蟻hsp90基因mRNA的表達(dá)；hsp90基因與USP基因表達(dá)有一定的相關(guān)性。

熱激蛋白90基因；RNA干擾；蛻皮激素受體；超氣孔蛋白

熱激蛋白(Heat shock protein,HSP)最早是由Ritossa在果蠅的粗線染色體上發(fā)現(xiàn)的。熱激蛋白是一類應(yīng)激蛋白，當(dāng)生物體處于高溫、低氧或紫外線照射等條件下，其表達(dá)量都會(huì)急劇增加[1-2]。熱激蛋白主要有5類：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60及小分子sHSP[3-4]。昆蟲體內(nèi)的熱激蛋白不僅與昆蟲的耐熱性有關(guān)，還與昆蟲的發(fā)育有重要的關(guān)系[5]。Huang等[3]克隆了斑潛蠅的3種小分子hsp(hsp19.5、hsp20.8和hsp21.7)和2種hsp60(TCP1A、TCP1F)基因,發(fā)現(xiàn)其總的表達(dá)趨勢(shì)是:小分子hsp在蛹期表達(dá)量最高,而大分子hsp60的表達(dá)量則隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行而遞增,說(shuō)明熱激蛋白不僅與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，還參與了昆蟲的變態(tài)行為。用注射法干擾赤擬谷盜第6齡期幼蟲體內(nèi)的hsp90基因后，這些幼蟲的發(fā)育將停留在蛹前階段，不能形成正常的復(fù)眼[6]。

對(duì)果蠅的研究證明，HSP70和HSP90參與了蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7-8]。在果蠅蛻皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，HSP70、HSP90及鈣調(diào)蛋白同源域64(Calponin homology domain64，Chd64)等輔助因子與蛻皮激素受體(Estrogen receptor-related receptor,EcR)和超氣孔蛋白(Ultraspiracle Protein，USP)形成的異源二聚體相互作用，從而激活EcR/USP和DNA的結(jié)合活性，HSP90對(duì)于蛻皮激素受體的激活具有必不可少的作用[4,9]。

RNA干擾(RNAi)指將雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，引起與dsRNA互補(bǔ)的內(nèi)源性mRNA特異性降解，導(dǎo)致此mRNA編碼的基因不表達(dá)，發(fā)生基因沉默的現(xiàn)象[10]。昆蟲RNAi的研究發(fā)展迅速，技術(shù)也日趨成熟。將dsRNA導(dǎo)入昆蟲的方法主要有注射法、飼喂法以及組織培養(yǎng)法等[11]，其中飼喂法是目前應(yīng)用較多一種方法，此種方法通過(guò)飼喂能夠表達(dá)dsRNA的菌株或人工飼料，使昆蟲連續(xù)攝入dsRNA，從而達(dá)到有效抑制靶基因表達(dá)的目的[12]。這種方法在多種昆蟲中被證明是可行的[13]。

HSP90參與昆蟲由蛻皮激素介導(dǎo)的信號(hào)通路，關(guān)于這方面的研究?jī)H在果蠅、棉鈴蟲等少數(shù)昆蟲中有報(bào)道[7，9]，而對(duì)于具有品級(jí)分化的社會(huì)性昆蟲擬黑多刺蟻，HSP90是否與EcR和USP存在相關(guān)性，還未見有報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)采用dsRNA飼喂方法，對(duì)擬黑多刺蟻3個(gè)品級(jí)成蟲進(jìn)行hsp90基因表達(dá)干擾，確定最適dsRNA干擾量，并利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法，分析dsRNA對(duì)各品級(jí)成蟲hsp90、EcR和USP基因mRNA水平表達(dá)量的影響，以期深入了解hsp90基因的功能，同時(shí)為將RNAi應(yīng)用于害蟲防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx 擬黑多刺蟻購(gòu)自浙江溫州瑞豐螞蟻工坊。購(gòu)回后，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以新鮮肉類、瓜果、蜂蜜以及冰糖等進(jìn)行人工喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為18～35 ℃，濕度為30%～40%。

1.1.2 主要試劑 Trizol 試劑、 SuperScriptTMFirs-t Strand Synthesis試劑盒，Taq酶、dNTP均購(gòu)自Takara公司;T7 RiboMAXTMExpress RNAi System由Promega公司提供;瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司;ABITaqMan2@PCR MasterMix，為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1hsp90基因片段的克隆 取擬黑多刺蟻工蟻5～6只，按照Trizol試劑的使用說(shuō)明提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度。將檢測(cè)合格的RNA用反轉(zhuǎn)試劑盒反轉(zhuǎn)為第一鏈cDNA。根據(jù)陜西師范大學(xué)動(dòng)物生殖與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室克隆得到的擬黑多刺蟻hsp90基因序列(GenBank序列號(hào)為JN100104.1)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物(5′→3′)為：AGGTCGCCAACAGTTCATTC，下游引物(5′→3′)為：CCAGACGACAAAGAGCAGT，送至南京金斯瑞公司進(jìn)行合成。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×PCR mix 5 μL，無(wú)菌水2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s,65 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,10個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 45 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min, 25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒回收，將回收片段送往南京金斯瑞公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)。在上下游引物的5′端加上T7啟動(dòng)子(TAATACGACTCACTATAGG)，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳、回收、測(cè)序(方法同前)。

1.2.2 dsRNA的合成 參照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒說(shuō)明書合成dsRNA，將dsRNA在室溫下不作處理放置不同時(shí)間段(0,2，4和6 h)后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其在常溫下的穩(wěn)定性，并用UVP紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶長(zhǎng)度是否符合要求。電泳條件：2 μL dsRNA原液+2 μL 6×loading buffer混勻后上樣，電壓120 V，時(shí)間15～20 min。取2 μL dsRNA原液，與 48 μL 0.1% DEPC處理水混勻，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度。最后將dsRNA于-20 ℃保存，備用。

1.2.3 擬黑多刺蟻的dsRNA喂食 隨機(jī)選取同一批次內(nèi)發(fā)育良好的30～40只不同品級(jí)的擬黑多刺蟻成蟲(工蟻、雄蟻、雌蟻)用于試驗(yàn)。用滅菌的DEPC水將合成的dsRNA分別稀釋成120，60，30，15與7.5 ng/μL的溶液飼喂擬黑多刺蟻成蟲。以僅喂食滅菌DEPC水的各品級(jí)擬黑多刺蟻成蟲作為對(duì)照。連續(xù)喂食14 d，每天記錄不同質(zhì)量濃度dsRNA處理成蟲的死亡數(shù)目。最后統(tǒng)計(jì)整個(gè)飼喂過(guò)程的累計(jì)死亡率。為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每個(gè)濃度重復(fù)3次喂養(yǎng)。

1.2.4 RNAi效應(yīng)檢測(cè) 分別設(shè)計(jì)目的基因hsp、EcR、USP實(shí)時(shí)定量引物和內(nèi)參基因β-actin特異性引物，引物序列如表1所示。

隨機(jī)取用6～8只30 ng/μL dsRNA飼喂的擬黑多刺蟻，提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)hsp90基因mRNA的表達(dá)變化。熒光實(shí)時(shí)定量PCR在StepOneTM熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行，每個(gè)樣本重復(fù)3次，設(shè)置不含cDNA模板的空白對(duì)照。最終結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用單因素方差進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

表1 擬黑多刺蟻hsp90、EcR、USP及β-actin基因的熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers used for expression analysis of hsp90，EcR，USP and β-actin in P.vicina

2 結(jié)果與分析

2.1 擬黑多刺蟻hsp90的克隆及dsRNA合成

2.1.1hsp90的克隆 提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)28S、18S和5S 3條帶(圖1)，表明RNA的完整性較好；經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280為1.8～2.0，表明RNA的純度符合要求，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。用特異性引物擴(kuò)增得到523 bp的擬黑多刺蟻hsp90片段(圖2)；經(jīng)純化試劑盒純化后，送南京金斯瑞公司測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增片段與目的片段相似性達(dá)95%以上，說(shuō)明得到了目的基因片段。在上、下游引物的5′端加上T7啟動(dòng)子后，擴(kuò)增得到了兩端帶有T7啟動(dòng)子序列的目的基因片段(圖2)，表明啟動(dòng)子成功添加，擴(kuò)增所得產(chǎn)物可以用于dsRNA的合成。

圖1 擬黑多刺蟻總RNA的凝膠電泳圖
M.DL2000 DNA Marker;1.總RNA
Fig.1 Total RNA ofP.vicina
M.DL2000 DNA Marker;1.Total RNA

2.1.2 dsRNA的合成 由圖3可知，體外合成獲得了523 bp的dsRNA，其在常溫下放置未發(fā)生降解。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280為1.8～2.0，表明dsRNA的純度符合要求，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 擬黑多刺蟻hsp90的PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DL2000 DNA Marker;1.引物5′端未添加T7啟動(dòng)子擴(kuò)增片段;2.引物5′端添加T7啟動(dòng)子后擴(kuò)增片段Fig.2 Amplification of hsp90 gene segments of P.vicina through RT-PCR M.DL2000 DNA Marker;1.Amplified fragments before without addition of the promoter;2.Amplified fragments in primer 5′ end add T7 promoter

2.2 飼喂dsRNA對(duì)擬黑多刺蟻死亡率的影響

飼喂不同質(zhì)量濃度dsRNA后，擬黑多刺蟻的死亡率見圖4。圖4結(jié)果表明，擬黑多刺蟻死亡率隨著dsRNA質(zhì)量濃度的增大而升高。120 ng/μL dsRNA喂食5 d試蟲全部死亡；60 ng/μL dsRNA可導(dǎo)致擬黑多刺蟻成蟲大量死亡，而15和7.5 ng/μL dsRNA對(duì)擬黑多刺蟻的死亡率影響較小，因此選用30 ng/μL作為dsRNA干擾擬黑多刺蟻hsp90基因的最佳質(zhì)量濃度。

2.3 RNAi對(duì)擬黑多刺蟻hsp90 mRNA表達(dá)的影響

用dsRNA喂食之后，擬黑多刺蟻的各個(gè)品級(jí)成蟲的hsp90基因在mRNA水平上的表達(dá)均顯著降低，且以雌蟻?zhàn)顬槊黠@，其hsp90基因的表達(dá)下降了76%；雄蟻hsp90表達(dá)下降了24.4%；工蟻hsp90的表達(dá)下降了31.1%(圖5)。

圖5 RNA干擾對(duì)擬黑多刺蟻成蟲hsp90基因mRNA表達(dá)的影響*表示與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。圖7同
Fig.5 Effect on the expression ofhsp90 gene mRNA inP.vicinaafter RNA interference *Represents significant difference atP<0.05 level. The same as Fig.7

2.4 RNA干擾擬黑多刺蟻成蟲hsp90后對(duì)EcR和USP mRNA表達(dá)的影響

2.4.1 對(duì)EcRmRNA表達(dá)水平的影響 如圖6所示，hsp90被干擾之后，擬黑多刺蟻所有品級(jí)成蟲EcR基因mRNA的表達(dá)水平均有一定變化，但差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。由此說(shuō)明，hsp90表達(dá)下調(diào)對(duì)EcR的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。

2.4.2 對(duì)USPmRNA表達(dá)水平的影響 如圖7所示，當(dāng)hsp90被干擾之后，擬黑多刺蟻所有品級(jí)成蟲USP基因表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)，其中以雄蟻的下調(diào)最為明顯，其USP基因表達(dá)降低了84.6%；其次是工蟻，降低了81%；雌蟻降幅最小，為50.3%(圖7)。

圖6 RNA干擾擬黑多刺蟻hsp90基因?qū)cR基因mRNA表達(dá)的影響
Fig.6 Expression ofEcRmRNA whenhsp90 ofP.vicinawas interfered by feeding dsRNA

圖7 RNA干擾擬黑多刺蟻hsp90基因?qū)SPmRNA表達(dá)水平的影響
Fig.7 Expression ofUSPmRNA whenhsp90 ofP.vicinawas interfered by feeding dsRNA

3 討 論

HSP90是一類很重要的伴侶蛋白，它與許多重要信號(hào)蛋白的構(gòu)象成熟有關(guān)，但是人們對(duì)它們相互之間的識(shí)別機(jī)制并不清楚[14]。對(duì)綠頭蠅的研究顯示，在其化蛹前hsp90的表達(dá)會(huì)突然增加。蛻皮激素可促進(jìn)蛹的形成，因此hsp90表達(dá)的增加可能是被蛻皮激素所誘導(dǎo)的[15]。研究表明，Hsp90對(duì)于果蠅體內(nèi)蛻皮激素活性的提高是必需的[7]。在棉鈴蟲的表皮細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，用dsRNA干擾hsp70基因的結(jié)果與敲除EcR和USP后的結(jié)果類似，而干擾hsp90后，會(huì)導(dǎo)致USP1、E75BP以及HR3表達(dá)下調(diào)，而這些基因均為20E相關(guān)基因，證明hsp90參與了20E信號(hào)通路;同時(shí)還發(fā)現(xiàn),敲除hsp90基因后，可以導(dǎo)致JH通路上的kr-h1表達(dá)下調(diào)，表明hsp90也參與了JH信號(hào)通路，因此hsp90可能是20E和JH通路形成“交叉互作”的一個(gè)重要基因[9]。

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)。目前,RNAi已在基因功能決定、基因敲除、癌癥治療以及抗病毒藥物開發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[10]。近些年來(lái)，研究人員已利用RNAi闡明了多種昆蟲相關(guān)基因的功能作用，而昆蟲RNAi的方法主要有注射法、飼喂法和組織培養(yǎng)法[11]。本試驗(yàn)采用飼喂法進(jìn)行RNAi，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 ng/μL dsRNA是對(duì)擬黑多刺蟻hsp90進(jìn)行干擾的最適質(zhì)量濃度。在此質(zhì)量濃度下，雌蟻hsp90基因的表達(dá)被抑制效果較好，說(shuō)明干擾hsp90對(duì)雌蟻的影響更大。成功干擾hsp90基因后，EcR的表達(dá)沒(méi)有顯著性變化，但是USP的表達(dá)顯著下調(diào)，且工蟻和雄蟻USP的表達(dá)下調(diào)較為明顯。說(shuō)明USP基因在成蟲階段可能與hsp90基因關(guān)系密切，其對(duì)工蟻及雄蟻生理功能有重要影響，對(duì)雌蟻影響不大。hsp90對(duì)于EcR和USP的作用與在棉鈴蟲和果蠅上的研究結(jié)果[6]類似，但是hsp90對(duì)USP表達(dá)的具體影響機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)通過(guò)飼喂dsRNA，成功干擾了擬黑多刺蟻hsp90基因的表達(dá)，同時(shí)證實(shí)hsp90與USP基因表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)，這為研究擬黑多刺蟻其他基因的功能提供了參考，同時(shí)也為將dsRNA應(yīng)用于害蟲防治，進(jìn)而開發(fā)新型農(nóng)藥提供了依據(jù)。

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RNA interference effect ofhsp90 gene and impacting on the mRNA expression ofEcRandUSPgenes inPolyrhachisvicinaRoger

FAN Jin-ying,YING Qiong-qiong,DANG Liang,XI Geng-si

(LaboratoryofAnimalReproductionandDevelopment,CollegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China)

【Objective】 This paper involve the function ofhsp90 gene inPolyrhachisvicinaRoger by using RNA interference technology,and provide the reference for the prevention and control of pests.【Method】 The total RNA was extracted by Trizol,reverse transcription synthetic cDNA first chain used for hsp90 gene cloning,double strand RNA (dsRNA) ofhsp90 gene was synthesized by T7 RiboMAXTMExpress RNAi System and the ants including female,male and wokers were fed by dsRNA at 120,60,30,15 and 7.5 ng/μL in 14 days.The adult mortalities were recorded,the most suitable dsRNA concentration was confirmed,and all grade of adults was taken by this dose interferece.The interference effect and interferencehsp90 gene effectingEcRas well asUSPmRNA expression was detected by fluorescent real-time quantitative RT-PCR.【Result】P.vicinahsp90 dsRNA was gotten by the synthesis according tohsp90 gene of fragment length 523 bp dsRNA was fed toP.vicinaants,the mortality increased along with the increased dsRNA concentration,P.vicinaants were all died in 120 ng/μL in 5 days.30 ng/μL maybe a appropriate choice.Under condition of 30 ng/μL,total RNA was extracted,the analysis of Florescent real-time quantitative RT-PCR indicates hsp90 mRNA ofP.vicinaants were suppressed in all grades.There are no significant change in the expression ofEcRmRNA ofP.vicinaand an obovious decrease of USP mRNA ofP.vicinaafter interferinghsp90.【Conclusion】 The interference ofhsp90 has been achived successfully as firstly,and preliminary analyze indicates that a correlation may be exited betweenhsp90 and USP.

heat shock protein 90 gene;RNA interference; ecdysone receptor;ultraspiracle protein

2013-10-22

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171195)

樊瑾瑛(1988-)，女，陜西渭南人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物生殖和發(fā)育研究。E-mail:fjy933@126.com

奚耕思(1956-)，女，上海浦東人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生殖和發(fā)育研究。E-mail:xigengsi@snnu.edu.cn

時(shí)間:2015-03-12 14:17

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.04.017

Q966

A

1671-9387(2015)04-0191-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150312.1417.017.html