姚力 蔡若蔚 何劍波 李會琪 楊美麗 黃銀輝 許盈盈 張恒 陳振杰

慢性間歇性缺氧對大鼠局灶性腦缺血再灌后神經(jīng)細胞凋亡的影響

姚力 蔡若蔚 何劍波 李會琪 楊美麗 黃銀輝 許盈盈 張恒 陳振杰

目的 觀察慢性間歇性缺氧(CIH)對大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積、神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞凋亡、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2)、Bax表達的變化，探討其對大鼠腦缺血再灌注后可能的神經(jīng)損害作用機制。方法 采用自制CIH系統(tǒng)對SD大鼠進行干預(yù)，然后采用Zea Longa等方法制備局灶性腦缺血再灌動物模型。將42只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=6)、模型組(n=12)、CIH 4周組(n=12)、CIH8周組(n=12)，光鏡觀察受損腦組織細胞的形態(tài)學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色法檢測腦組織Bcl-2和Bax 蛋白表達水平，TUNEL法檢測腦細胞凋亡情況，TTC染色檢測梗死體積，利用神經(jīng)功能缺損評分評價神經(jīng)功能缺損情況。結(jié)果 TUNEL染色陽性細胞主要分布在壞死灶的周邊和皮質(zhì)區(qū)。CIH8周組大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分、腦細胞凋亡數(shù)高于模型組和CIH 4周組(均P<0.05)。與模型組比較，CIH8周組Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，Bax蛋白表達增強(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)，CIH4周組Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值亦較模型組降低(P<0.05)。而CIH8周組和CIH4周組間Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 (1)CIH可增加腦缺血再灌后大鼠神經(jīng)功能缺損、梗死體積。(2)隨CIH時間延長，大鼠腦缺血后缺血半暗帶的細胞凋亡增加，Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)。Bcl-2/Bax的變化可能參與了CIH 對腦缺血后細胞凋亡過程的調(diào)控。

缺氧缺血，腦；再灌注損傷；bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；細胞凋亡

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS) 和腦卒中均是臨床上的常見病，老年人的高發(fā)病。腦缺血再灌注損傷的發(fā)生是多種因素及多種機制參與的復(fù)雜的病理生理過程。研究證明OSAS是腦卒中的獨立危險因素[1-2]。Martinez-Garcia等對166例缺血性腦卒中合并睡眠呼吸暫停的患者進行了5年的隨訪調(diào)查研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中合并OSAS患者的死亡率明顯增加，并且使用持續(xù)氣道正壓通氣(continuous positive airway pressure, CPAP)治療后，能夠降低患者死亡風(fēng)險[3]，提示OSAS可增加缺血性腦卒中患者的病死率。近年研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷遲發(fā)性神經(jīng)元死亡過程中神經(jīng)細胞可發(fā)生凋亡，細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要形式之一[4]。慢性間歇性缺氧(CIH)的氧氣濃度變化很大程度上模擬了缺血再氧和的過程。本實驗通過觀察CIH對大鼠腦缺血再灌注后腦組織B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bax的表達變化，旨在探討其對大鼠腦缺血/再灌注后可能的神經(jīng)損害作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性8周齡 SD大鼠 52只，體質(zhì)量180～200 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。隨機取10用于CIH預(yù)實驗，另42只隨機分為假手術(shù)組(n=6)、缺血再灌注24 h組(模型組，n=12)、CIH4周組(n=12)、CIH8周組(n=12)。模型組、CIH4周及CIH8周組隨機取6只用于腦梗死體積檢測，另6只進行Bax、Bcl-2蛋白表達檢測。

1.2 CIH系統(tǒng) 間歇性缺氣系統(tǒng)S-450氧氣檢測報警儀購于加拿大BW.Technologies公司，靈敏度0.1%。自制密閉有機玻璃箱，并預(yù)留進出氣孔，出氣孔使用單向活瓣。自制控制系統(tǒng)：由微電腦芯片、繼電器、電磁閥、顯示器等組成，編寫控制軟件進行程序控制。使用專用塑料導(dǎo)管連接密閉箱與控制系統(tǒng)。醫(yī)用壓縮氧氣濃度>99%，壓縮氮氣濃度>99% (福州氧氣廠提供)。Atman-6500空氣泵。

1.3 方法

1.3.1 大鼠CIH預(yù)實驗：參照譚勝玉等[5]方法將大鼠以苯巴比妥鈉按體質(zhì)量100 mg/kg腹腔注射麻醉，將其腹部朝上固定在缺氧艙內(nèi)解剖臺上，局部消毒后，切開腹部皮膚，分離腹主動脈，其中5只在缺氧艙內(nèi)氧濃度最低點30 s內(nèi)直視下抽取腹主動脈血行血氣分析，另 5只大鼠在循環(huán)充氣過程中當(dāng)缺氧艙內(nèi)氧濃度恢復(fù)至21%時按同樣方法抽取。參照文獻[6-7]方法自制密閉有機玻璃箱，并預(yù)留操作孔由透明薄膜密封進出氣孔，其中出氣孔使用單向活瓣。箱內(nèi)氣體不斷流動,以避免二氧化碳潴留。不同氣源有不同的通氣管道，均由程序控制的電磁閥開關(guān)。通過控制程序及設(shè)定各種氣體的吹入時間及流量，調(diào)控箱內(nèi)氧濃度，使得每一間斷性缺氧循環(huán)時間為4 min，其中各種氣體吹入時間順序為：氮氣120 s，靜息30 s，氧氣60 s，空氣30 s。各種氣體流入狀態(tài)可通過控制程序經(jīng)顯示器讀出。箱內(nèi)氧濃度由箱內(nèi)氧氣檢測報警儀讀出，在進行動物實驗前，連續(xù) 20個循環(huán)，每隔20 s記錄箱內(nèi)的氧濃度，取平均值，制作循環(huán)中箱內(nèi)氧濃度變化趨勢圖。

1.3.2 局灶性腦缺血再灌大鼠模型制備：參照文獻[8]制備栓線，參照Zea Longa等[9]方法制備局灶性腦缺血再灌動物模型，腦缺血2 h后再灌注24 h。參考Zea Longa等[9]方法對大鼠進行評分，評分為0分和4分的大鼠均被剔除，符合評分但有蛛網(wǎng)膜下腔出血、手術(shù)中動物死亡亦予以剔除，用同一批次的造模成功大鼠補足數(shù)量。假手術(shù)組栓線插入深度為8～10 mm，其余操作同手術(shù)組。

1.3.3 CIH干預(yù)處理：CIH8周組和CIH4周組大鼠分別于造模前8周和4周給予CIH干預(yù)。每天8:00至16:00時將CIH組大鼠置于間斷缺氧系統(tǒng)的密閉箱中經(jīng)歷間歇缺氧，16:00時以后使大鼠生活于大氣環(huán)境中。假手術(shù)組和模型組大鼠在相同條件下飼養(yǎng)，但未給予CIH干預(yù)。

1.3.4 免疫組化：腦缺血再灌注24 h后將大鼠斷頭取腦，以視交叉和其后4 mm處兩點行冠狀切片，片厚4 mm，經(jīng)梯度酒精脫水固定、切片、經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以備HE染色、TUNEL染色和免疫組織化學(xué)染色。將每張切片于鏡下隨機選取6個不重疊的400倍視野，使用顯微照相攝片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)測量累積吸光度值(integrated optical density，IOD) 表示Bcl-2、Bax表達水平。Bcl-2、Bax陽性細胞為胞質(zhì)黃染。免疫組化檢測設(shè)陽性對照(從福州邁新公司購買的陽性對照片作陽性對照)和陰性對照(用PBS液代替一抗作空白對照)。

1.3.5 腦梗死體積檢測：將鼠腦切除小腦和低位腦干，每隔2 mm連續(xù)冠狀切片，共5片。采用TTC染色法進行腦梗死體積測定，利用Luxex F圖像分析儀測每個腦片的梗死面積，根據(jù)公式V=t(A1+A2+…An) -(A1+An)t/2計算梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行檢驗，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 箱內(nèi)氧濃度測定及大鼠血氣分析 每一次循環(huán)間歇缺氧艙內(nèi)最低氧濃度達(8.29±0.31)%，最高氧濃度(23.30±0.47)%(圖1)。在缺氧循環(huán)中，氧濃度達到8.3%左右時，大鼠動脈血氧飽和度為36.4%～60.5%，血氧分壓為23.9～32.6 mmHg，當(dāng)氧濃度達到21%左右時，大鼠動脈血氧飽和度為93.2%～97.4%，動脈血氧分壓為74.7～108.4 mmHg，其血氧飽和度符合人類重度OSAS(SaO2<80%)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 間歇性缺氧箱內(nèi)氧濃度變化趨勢圖(1個周期)

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及梗死體積比較 假手術(shù)組神經(jīng)功能缺損評分為0分，且雙側(cè)半球均無梗死灶。CIH8周組大鼠神經(jīng)功能缺損評分及梗死體積與CIH4周組和模型組比較升高(均P<0.05)，而CIH4周組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。見表1。

表 1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積比較

注：CIH：慢性間歇性缺氧，圖2～3、表2同；與模型組比較，*P<0.05；與CIH4周組比較，△P<0.05

2.3 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，未見缺血缺氧性改變，其余各組梗死區(qū)主要位于右側(cè)額、頂部皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)等腦區(qū)。模型組梗死灶中心區(qū)神經(jīng)細胞脫失明顯，額葉皮質(zhì)區(qū)和紋狀體內(nèi)側(cè)部(相當(dāng)于缺血半暗帶區(qū))出現(xiàn)大片空泡區(qū)，炎性細胞浸潤明顯，高倍鏡下梗死區(qū)周圍神經(jīng)元固縮、核淡染，間質(zhì)水中。CIH4周組神經(jīng)元皺縮、細胞間質(zhì)疏松、核淡染。CIH8周組可見明顯水腫，在額、頂部皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元固縮，部分神經(jīng)元脫失，染色淺，細胞間質(zhì)疏松明顯，核不規(guī)則，核仁不清。結(jié)果見圖2。

2.4 細胞凋亡檢測 假手術(shù)組未見凋亡細胞，其余各組大鼠凋亡細胞主要分布在額葉皮質(zhì)區(qū)及紋狀體內(nèi)側(cè)(相當(dāng)于缺血半暗帶區(qū))，凋亡細胞呈藍黑色、黑色，胞核固縮深染，呈多邊形、錐形、橢圓形、圓形及不規(guī)則形，并發(fā)出突起,可見凋亡小體(圖3)。CIH8周組TUNEL陽性細胞數(shù)較模型組和CIH4組升高(均P<0.05)，而CIH4周與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.5 免疫組化檢測結(jié)果

2.5.1 Bax的免疫組化表達：結(jié)果見表2、圖4。假手術(shù)組未見Bax蛋白表達；在額葉皮層及紋狀體內(nèi)側(cè)(相當(dāng)于缺血半暗帶區(qū))，另3組均可見Bax免疫染色陽性細胞，細胞質(zhì)呈棕黃色、棕褐色。CIH8周組Bax免疫染色陽性細胞表達高于模型組(P<0.05)，余兩兩比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。

A：假手術(shù)組(×200)；B：模型組(×400)；C：CIH4周組(×400)；D：CIH8周組(×400)

圖2 各組大鼠腦梗死區(qū)周圍神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)改變(HE)

A：假手術(shù)組；B、C：分別為模型組和CIH4組，均可見少量凋亡細胞；D：CIH8周組可見大量凋亡細胞

圖3 各組大鼠腦神經(jīng)細胞凋亡細胞數(shù)比較(TUNEL染色，×400)

表 2 各組大鼠腦組織免疫組化結(jié)果比較±s)

注：IOD：累積吸光度；與模型組比較，*P<0.05；與CIH4組比較，△P<0.05

A：假手術(shù)組未見Bax免疫陽性細胞；B、C：分別為模型組和CIH4周組，均可見Bax免疫陽性細胞表達較弱；D：CIH8周組可見Bax免疫陽性細胞表達增強

圖4 各組Bax蛋白免疫組化表達比較(MaxVisionTM一步法，×400)

A：假手術(shù)組可見Bcl-2免疫陽性細胞微弱表達(箭頭所示)；B：模型組可見Bcl-2免疫陽性細胞表達強；C、D：分別為CIH4周組和CIH8周組，均可見Bcl-2免疫陽性細胞表達較弱

圖5 各組Bcl-2蛋白免疫組化表達比較(MaxVisionTM一步法，×400)

2.5.2 Bcl-2蛋白表達：假手術(shù)組可見微量Bcl-2蛋白表達；在額葉皮層及紋狀體內(nèi)側(cè)(相當(dāng)于缺血半暗帶區(qū))，另3組均可見Bcl-2免疫染色陽性細胞，陽性染色細胞胞質(zhì)呈棕黃色(圖5)。CIH8周組和CIH4周組Bcl-2蛋白表達較模型組降低(均P<0.05)，而CIH8周組與CIH4周組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.5.3 各組Bcl-2/Bax蛋白表達比值：CIH8周組和CIH4周組Bcl-2/Bax蛋白比值較模型組降低(均P<0.05)，而CIH8周組與CIH4周組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

3 討論

CIH的氧氣濃度的變化很大程度上模擬了缺血再氧合的過程[10-12]與缺血再灌注類似的過程[13]。本實驗觀察了CIH對腦缺血再灌24 h大鼠模型腦組織Bcl-2和Bax蛋白表達及神經(jīng)細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，CIH8周組Bcl-2蛋白表達減低，Bax蛋白表達增強，同時Bcl-2/Bax比值減低；CIH4周Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值較模型組減低，而CIH4周組Bax蛋白表達與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；另外，CIH8周組神經(jīng)細胞凋亡明顯增多，而CIH4周組神經(jīng)細胞凋亡與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示CIH可使大鼠腦缺血后缺血半暗帶的神經(jīng)細胞凋亡增加；Bcl-2 和 Bax 這一對凋亡抑制和促進基因參與了CIH對腦缺血后細胞凋亡過程的調(diào)控。CIH后細胞凋亡增加和凋亡相關(guān)基因Bcl-2 和 Bax的表達異常可能參與了腦缺血再灌神經(jīng)元的損傷，可能是加重腦缺血后神經(jīng)元損傷的原因之一。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均為0分，且無梗死灶，而其余各組大鼠神經(jīng)功能缺損的評分多為2～3分，2分以上的大鼠腦水腫征象尤為明顯，0～1分者，腦水腫不明顯。CIH8周組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分及腦梗死體積均比其余各組增高，而CIH4周組與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，提示隨缺氧時間的延長，缺氧程度的加重，CIH可加重腦缺血再灌后大鼠神經(jīng)功能缺損，并增加大鼠腦梗死的體積。

睡眠是一項重要的生理活動，在人類正常睡眠過程中，不同的睡眠時相對心、肺、腦血管進行著不同的調(diào)控。急性呼吸暫停事件發(fā)生時常伴發(fā)腦血流量急劇下降[14]，夜間睡眠期間呼吸暫停事件反復(fù)發(fā)作引起的腦缺血作用可因相關(guān)的低氧血癥以及業(yè)已存在的腦血管自動調(diào)節(jié)功能損害和血管舒張功能受損而加重。目前研究認為夜間睡眠期間頻繁發(fā)作的呼吸暫停事件擾亂了正常睡眠與心血管系統(tǒng)間的相互生理作用[15]。OSAS對心血管的影響因素涉及神經(jīng)、體液、血管和炎性反應(yīng)異常。目前認為，OSAS引起的血流動力學(xué)變化以及血管、炎性反應(yīng)、血栓病機制和氧化應(yīng)激改變均可能是腦血管疾病的危險因素。CIH加重腦缺血再灌注損傷的可能機制與下列危險因素有關(guān)：(1)血流動力學(xué)、血凝改變及血管內(nèi)皮損傷：由于呼吸暫停造成低氧血癥，使紅細胞增多而致血液黏度增高。研究結(jié)果顯示OSAS患者存在明顯的血小板活化，血小板黏附，血小板的高黏附狀態(tài)可以造成微循環(huán)淤滯[6]。陳曉陽等通過CIH小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)CIH可以引起心肌缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)表達增加，并可以促進HIF-1α的目的基因產(chǎn)物血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、內(nèi)皮素1(ET-1)的表達，并認為這種病理生理過程可能在OSAS合并心血管系統(tǒng)損害的發(fā)病機制中起到了重要作用[7]。血管內(nèi)皮長期慢性的損害，血小板聚集性增強，血流緩慢、甚至受阻，腦血流量減少，可能造成腦缺血再灌注損傷的增加。(2)交感神經(jīng)活性增強：OSAS患者交感神經(jīng)對周圍血管的活性明顯增高，甚至在白天含氧量正常的清醒狀態(tài)時也同樣如此[8]。目前交感神經(jīng)活性增加的機制尚不清楚。然而，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強和血漿兒茶酚胺水平增高，在長期兒茶酚胺的作用下，血管平滑肌發(fā)生重構(gòu)和肥厚，也可導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損害，這些損害因素也可導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的增加。(3)氧化應(yīng)激：夜間頻繁呼吸暫停引發(fā)的間歇性低氧和再灌注，不僅產(chǎn)生大量高度活化的氧自由基，也對血管壁產(chǎn)生缺血再灌注損傷[9,13]。Singh等研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激能夠加重OSAS患者的病情，使用抗氧化藥物可以改善OSAS患者的睡眠質(zhì)量[16]。(4)炎性反應(yīng)的增加：OSAS引發(fā)的低氧血癥可以啟動炎性細胞因子的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)睡眠呼吸暫?；颊甙准毎樗?、腫瘤壞死因子α和C反應(yīng)蛋白水平增高[17-18]。

綜上所述，隨著CIH時間延長，腦缺氧程度加重，可使大鼠腦缺血后缺血半暗帶的神經(jīng)細胞凋亡增加，Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bcl-2/Bax比值減小。Bcl-2 和 Bax 這一對凋亡抑制和促進基因參與了CIH 對腦缺血后細胞凋亡過程的調(diào)控，這可能是CIH增加腦缺血再灌后損傷的部分機制之一。

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(本文編輯：時秋寬)

The effects of chronic intermittent hypoxia on the neuron apoptosis in rats after focal cerebral ischemia-reperfusion injury

YAOLi,CAIRuowei*,HEJianbo,LIHuiqi,YANGMeili,HUANGYinhui,XUYingying,ZHANGHeng,CHENZhenjie.

*DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity，F(xiàn)uzhouFujian362000，China

CAI Ruowei，Email：rwcai@163.com

Objective To observe the effect of chronic intermittent hypoxia (CIH) on the infarction volume, neuron morphous, neuron apoptosis and the expression of Bcl-2, Bax in rat brain after ischemia reperfusion, and to explore the possible mechanism of nerve damage of CIH in rats after ischemia reperfusion. Methods SD rats were intervened by homemade CIH system and then, focal cerebral ischemia reperfusion animal models were prepared by Zea Longa method, etc. Forty two healthy male rats were randomly divided into sham operation group (n=6), model group (ischemia-reperfusion 24 hours group,n=12), CIH 4 weeks group (cerebral ischemia-reperfusion combining CIH exposure for 4 weeks,n=12), and CIH 8 weeks group (cerebral ischemia-reperfusion combining CIH exposure for 8 weeks,n=12). The morphological changes of the damaged tissue cells were observed by light microscope. The expression of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry. The cell apoptosis and infarction volume were investigated via dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) staining and TTC staining respectively. The national institutes of health stroke scale (NIHSS) were used to evaluate the neurologic deficits. Results TTC staining, TUNEL staining and NIHSS results showed that the infarction volume, neurologic deficits and the number of apoptotic cells in CIH 8 weeks group was much higher than other groups (P<0.05); in CIH 8 weeks group, TUNEL-positive cells were more apparent in the perilesional tissue and cortex. Compared with the model group, the protein expression of Bcl-2 was reduced, while the expression of Bax was enhanced; moreover, the ratio of Bcl-2/Bax was decreased in CIH 8 weeks group (P<0.05). Compared with the model group, the protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax were significantly reduced in CIH 4 weeks group (P<0.05), but there were no statistical significant differences of the expression of Bcl-2, Bax and the ratio of Bcl-2/Bax between CIH 4 weeks group and CIH 8 weeks group. Conclusions These results indicated that CIH could enhance the infarction volume and neurologic deficits in rats after cerebral ischemia reperfusion and along with CIH, the number of apoptotic cells and the expression of Bax were increased, and the expression of Bcl-2 was decreased, suggesting that the ratio of Bcl-2/Bax may take part in the regulation of cell apoptosis after cerebral ischemia by CIH.

hypoxia-ischemia,brain; reperfusion injury; bcl-2-associated X protein; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.007

710077陜西省西安市中國西電集團醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(姚力、何劍波、李會琪、張恒)；362000福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(蔡若蔚、楊美麗、許盈盈)；362400福建省晉江市醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(黃銀輝)；362400福建省安溪縣醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(陳振杰)

蔡若蔚，Email：rwcai@163.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)03-0182-06

2014-08-28)