李義沙 任玉騰 任士卿

頭孢曲松鈉減輕水通道蛋白4抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用

李義沙 任玉騰 任士卿

目的 探討頭孢曲松鈉在水通道蛋白4(AQP4)抗體誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用以及機(jī)制。方法 常規(guī)體外培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為4組，分別加入健康人血清(對(duì)照組)、AQP4抗體陽(yáng)性患者血清、頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清以及單純頭孢曲松鈉。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后采用免疫組織化熒光染色觀察不同組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的變化，采用比色法測(cè)定上清液谷氨酸濃度以及免疫印跡分析谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLT-1)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 和對(duì)照組比較，AQP4抗體陽(yáng)性血清組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLT-1)蛋白表達(dá)明顯減少，上清液谷氨酸濃度明顯增高(均P<0.01)，而單純頭孢曲松鈉組僅顯著增加GLT-1蛋白表達(dá)(P<0.01),并不影響星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和谷氨酸水平(P>0.05)；和AQP4抗體陽(yáng)性組比較，頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和GLT-1蛋白表達(dá)增加，上清液谷氨酸濃度明顯下降(P<0.01)。結(jié)論 頭孢曲松鈉可能通過(guò)上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)、減少細(xì)胞外液谷氨酸水平發(fā)揮減輕AQP4抗體對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用。

視神經(jīng)脊髓炎；水通道蛋白4；頭孢曲松；谷氨酸；谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1；星形膠質(zhì)細(xì)胞

視神經(jīng)脊髓炎(NMO)是一種自身免疫性炎性脫髓鞘性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。隨著研究進(jìn)展，越來(lái)越多的證據(jù)支持水通道蛋白-4(AQP4)抗體在NMO發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。AQP4抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞突觸膜上的AQP4結(jié)合產(chǎn)生補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性作用和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，引起星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡、炎性反應(yīng)細(xì)胞聚集、炎性反應(yīng)因子釋放和血-腦脊液屏障的破壞，導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡、髓鞘丟失以及神經(jīng)元死亡，產(chǎn)生NMO的病理改變[1]。既往研究表明AQP4抗體和AQP4結(jié)合引起星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLT-1)內(nèi)陷、下調(diào)GLT-1表達(dá)和星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸再攝取下降，推測(cè)其導(dǎo)致的細(xì)胞外谷氨酸濃度增加是神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡原因之一[2-3]。上述研究結(jié)果提示谷氨酸興奮性毒性作用涉及NMO的發(fā)病機(jī)制。但也有研究指出AQP4抗體并不引起星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1內(nèi)陷和谷氨酸攝取率的下降[4]，故谷氨酸興奮性毒性作用在NMO發(fā)病機(jī)制中的作用仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

作者研究小組既往研究證實(shí)AQP4抗體陽(yáng)性血清能導(dǎo)致體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞中星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡，小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元死亡[5]。同時(shí)β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松鈉能上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá),通過(guò)減少細(xì)胞外谷氨酸濃度在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[6]。本研究采用大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，觀察頭孢曲松鈉對(duì)AQP4抗體陽(yáng)性血清誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用、GLT-1表達(dá)以及細(xì)胞上清液谷氨酸濃度的影響，旨在探討頭孢曲松鈉在AQP4抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：出生24 h之內(nèi)SD大鼠新生鼠10只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證編號(hào)：1403062)。

1.1.2 主要試劑和儀器：DMEM/F12購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；多克隆AQP4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)購(gòu)自美國(guó)NeoMarkers公司；頭孢曲松鈉購(gòu)自上海羅氏制藥公司；谷氨酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；豚鼠抗大鼠GLT-1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Western blotting電泳設(shè)備為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的抗兔IgG熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Forma公司；TE2000-U型倒置熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.1.3 血清來(lái)源：AQP4抗體陽(yáng)性血清來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者。該患者女，41歲，視神經(jīng)炎和脊髓炎反復(fù)發(fā)作，使用AQP4抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定其血AQP4抗體濃度為215.53 μmol/L。健康人血清取自同年齡健康查體者。取早晨空腹靜脈血，高速離心機(jī)離心3 min(離心加速度1335g)，血清分裝并保存在-80℃冰箱備用。本研究得到河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)[5]：取出生24 h之內(nèi)的SD大鼠大腦皮質(zhì)，剝離腦膜和血管后移至裝有1 mL PBS的器皿中，用解剖剪剪碎皮質(zhì)組織，加入1 mL 0.25%(質(zhì)量濃度)的胰酶，置于37℃ 5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育消化20 min。加入含20%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，移入離心管中。用玻璃吸管反復(fù)輕輕吹打，機(jī)械分離后制成單細(xì)胞懸液。離心5 min(離心加速度356g)，棄上清液，加含20%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。吹打細(xì)胞后400目細(xì)胞濾器過(guò)濾，將細(xì)胞接種于預(yù)先包被多聚賴氨酸的35 mm的培養(yǎng)皿中，于37℃ 5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2孵育箱內(nèi)孵育。分別于24 h、72 h、6 d時(shí)換液。培養(yǎng)6 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：將培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞分正常血清對(duì)照組、AQP4抗體陽(yáng)性血清組、頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組以及單純頭孢曲松鈉組。具體操作如下：細(xì)胞培養(yǎng)6 d后，頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組和單純頭孢曲松鈉組先給予含有10 μmol/L 頭孢曲松鈉的DMEM/F12培養(yǎng)液換液，48 h后正常血清對(duì)照組加入10%(體積分?jǐn)?shù))的正常人血清，AQP4抗體陽(yáng)性血清組和頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組分別加入等量AQP4抗體陽(yáng)性患者血清，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞GLT-1蛋白表達(dá)水平及培養(yǎng)液上清谷氨酸含量測(cè)定。

1.2.3 免疫細(xì)胞熒光染色：細(xì)胞用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)漂洗3次，4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛室溫固定30 min，0.2%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100透化細(xì)胞5 min，10%(體積分?jǐn)?shù))山羊血清室溫下封閉細(xì)胞45 min，加入鼠抗GFAP(1∶200)，4℃過(guò)夜，再加入山羊抗鼠IgG(1∶100)封閉30 min，Hoechst33258(10 μg/mL)復(fù)染胞核。在倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)不相同的視野，使用NIS-Elements BR 3.0軟件采樣，應(yīng)用Image Pro-Plus軟件計(jì)算每個(gè)高倍視野下GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取平均值。

GFAP：神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白；AQP4：水通道蛋白4；A：正常血清對(duì)照組；B：AQP4抗體陽(yáng)性血清組；C：?jiǎn)渭冾^孢曲松鈉組；D：頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果(免疫細(xì)胞熒光染色×200)

1.2.4 Western blotting檢測(cè)GLT-1蛋白表達(dá)：培養(yǎng)的細(xì)胞棄上清，預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解15 min，振蕩后收集上清，4℃以12 000g高速離心15 min，收集上清即為總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后分裝于-80℃保存。配制并灌注12%(體積分?jǐn)?shù))SDS-PAGE的分離膠和5%(體積分?jǐn)?shù))濃縮膠，取蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液混勻，100℃水浴5 min，每孔上樣50 μg總蛋白，進(jìn)行電泳。電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜置于5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉中，37℃，封閉1 h。一抗孵育4℃過(guò)夜，取出置于37℃孵育箱中靜置1 h復(fù)溫。復(fù)溫結(jié)束后，用TPBS溶液振洗3次，每次15 min。二抗孵育PVDF膜，置于37℃搖床緩慢搖動(dòng)1 h。洗膜后三抗孵育PVDF膜，37℃孵育箱靜置1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯色。以灰度值表示GLT-1的表達(dá)水平，樣本數(shù)為20。

1.2.5 細(xì)胞上清液谷氨酸濃度測(cè)定：提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較 AQP4抗體陽(yáng)性血清組星形膠質(zhì)細(xì)胞較正常血清對(duì)照組明顯減少(P<0.01)；頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組較AQP4抗體陽(yáng)性血清組明顯增加(P<0.01)；而單純頭孢曲松鈉組和正常血清對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

表 1 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目、谷氨酸濃度和GLT-1蛋白表達(dá)

注：GLT-1：谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1，圖2同；A：正常血清對(duì)照組；B：AQP4抗體陽(yáng)性血清組；C：頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組；D：?jiǎn)渭冾^孢曲松鈉組；與A組比較，#P<0.01；與B組比較，*P<0.01

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1蛋白表達(dá)的變化 單純頭孢曲松鈉組GLT-1表達(dá)較正常血清對(duì)照組明顯增加，AQP4抗體陽(yáng)性血清組GLT-1表達(dá)水平較對(duì)照組減少，頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組較AQP4抗體陽(yáng)性血清組GLT-1表達(dá)增加(均P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。

1：正常血清對(duì)照組；2：?jiǎn)渭冾^孢曲松鈉組；3：AQP4抗體陽(yáng)性血清組；4：頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組

圖2 Western blotting檢測(cè)各組大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1蛋白的表達(dá)

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中谷氨酸濃度變化 AQP4抗體陽(yáng)性血清組谷氨酸濃度較正常血清對(duì)照組明顯增高(P<0.01)；頭孢曲松鈉+AQP4抗體陽(yáng)性血清組組谷氨酸水平較AQP4抗體陽(yáng)性血清組明顯下降(P<0.01)；而單純頭孢曲松組谷氨酸水平與正常血清對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的神經(jīng)興奮性遞質(zhì)，谷氨酸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不僅能維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常突觸傳遞功能，而且能阻止谷氨酸對(duì)神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞的損害[7]。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)GLT-1轉(zhuǎn)運(yùn)90%細(xì)胞外谷氨酸[8]，故星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上GLT-1在維持細(xì)胞外液谷氨酸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮主要作用。β-內(nèi)酰胺抗生素頭孢曲松鈉能增加GLT-1的表達(dá)和活性[6]，在缺血缺氧性腦病、急性腦卒中、肌萎縮側(cè)索硬化等疾病模型中已經(jīng)證實(shí)其通過(guò)上調(diào)GLT-1表達(dá)，減輕谷氨酸興奮性毒性作用[9]。但其對(duì)AQP4抗體誘導(dǎo)的大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，頭孢曲松鈉能明顯減輕AQP4抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損害，而單獨(dú)頭孢曲松鈉對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目并無(wú)影響，提示頭孢曲松鈉能減輕AQP4抗體血清對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用。利用免疫印跡法測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組的GLT-1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純頭孢曲松鈉能上調(diào)GLT-1表達(dá)，AQP4抗體陽(yáng)性血清可明顯降低GLT-1表達(dá)，而給予頭孢曲松鈉能減輕AQP4抗體陽(yáng)性血清誘導(dǎo)的GLT-1表達(dá)下調(diào)，提示其可能通過(guò)上調(diào)GLT-1表達(dá)發(fā)揮其保護(hù)作用。既往研究表明AQP4抗體并不引起星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)減少和谷氨酸攝取率下降，認(rèn)為GLT-1表達(dá)減少是由于AQP4抗體導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞破壞和數(shù)目減少所致[4]。故本研究AQP4抗體陽(yáng)性血清引起GLT-1下調(diào)，不能完全除外星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的影響因素。即使如此頭孢曲松鈉也能通過(guò)增加存活的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)，減少AQP4抗體陽(yáng)性血清引起的GLT-1下調(diào)。

該研究利用比色法測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組上清液谷氨酸濃度發(fā)現(xiàn)，AQP4抗體陽(yáng)性血清組谷氨酸濃度明顯高于對(duì)照組，頭孢曲松鈉預(yù)處理能明顯減少AQP4抗體導(dǎo)致的谷氨酸濃度增加，提示AQP4抗體和星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4結(jié)合破壞細(xì)胞外谷氨酸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度升高。頭孢曲松鈉通過(guò)上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1蛋白表達(dá)，增加其攝取谷氨酸，減少細(xì)胞外谷氨酸濃度，糾正AQP4抗體導(dǎo)致的細(xì)胞外液谷氨酸內(nèi)環(huán)境紊亂。谷氨酸可以通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡[12]，故推測(cè)頭孢曲松鈉通過(guò)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)和谷氨酸攝取率，減少谷氨酸導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞，減輕AQP4抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損害。

綜上所述，本研究表明在體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞體系中，頭孢曲松鈉通過(guò)上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)，減少細(xì)胞外液谷氨酸濃度，減輕AQP4抗體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用，也間接表明谷氨酸興奮性毒性作用可能涉及NMO的發(fā)病機(jī)制。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

Ceftriaxone attenuates the cytotoxic effect of anti-aquaporin-4 antibody on astrocytes

LIYisha,RENYuteng,RENShiqing*.

*DepartmentofNeurology,ThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,ShijiazhuangHebei050051,China

REN Shiqing,Email:renshiq6666@163.com

Objective To observe the effects of ceftriaxone on toxicity of water channel protein-4 (aquaporin-4，AQP4) antibody to astrocytes and the possible mechanisms. Methods The routine methods were used to extract cortical cells from 1-day-old Sprague-Dawley rats, the cultured cerebral cortical cells were treated with healthy sera, AQP4 antibody positive sera, ceftriaxone + AQP4 antibody positive sera, ceftriaxone respectively. After 24 h cultivation, the number of astrocytes was observed by immunofluorescence staining. The glutamate concentration in the supernatants was measured by colorimetry, and the expression of glial glutamate transporter-1(GLT-1) was evaluated by western blot. Results The number of astrocytes and expression of GLT-1 in astrocytes were significantly decreased and the glutamate concentration was significantly increased in the AQP4 antibody positive group compared with the control group (P<0.01). Ceftriaxone increased the expression of GLT-1 (P<0.01), and did not change the number of astrocytes and the glutamate concentration comparing the ceftriaxone only group with the control group (P>0.05). The number of astrocytes and expression of GLT-1 in astrocytes were significantly increased and the glutamate concentration was significantly decreased in the ceftriaxone+AQP4 antibody positive group compared with the AQP4 antibody positive group (P<0.01). Conclusions Ceftriaxone could attenuates the cytotoxic effect of anti-aquaporin-4 antibody on cultured rat cortical astrocytes by upregulating the expression of GLT-1 in astrocytes and decreasing the glutamate concentration in the extracellular fluid.

neuromyelitis optica; aquaporin-4; ceftriaxone; glutamic acid; glial glutamate transporter-1; astrocytes

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.003

056002邯鄲第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(李義沙)；050000 河北醫(yī)科大學(xué)2010級(jí)本碩生(任玉騰)；050051 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(任士卿)

任士卿，Email:renshiq6666@163.com

R744.5+2

A

1006-2963 (2015)03-0162-04

2014-10-10)