李曉玲 張博 于春梅 閻湘 王滿俠

Th17/Treg細胞在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化中的表達

李曉玲 張博 于春梅 閻湘 王滿俠

目的 探討輔助T細胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)相關(guān)細胞因子白細胞介素17(IL-17)和白細胞介素35(IL-35)在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(RRMS)發(fā)病機制中的作用及甲潑尼龍對其表達的影響。方法 收集急性期RRMS患者36例，神經(jīng)系統(tǒng)非炎性疾病患者32例作為對照組，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測兩組患者治療前及治療后2周時血清和腦脊液中IL-17、IL-35的水平。結(jié)果 RRMS組治療前血清和腦脊液IL-17水平顯著高于對照組(P<0.01)，而其IL-35水平均低于對照組(P<0.05)。與治療前相比，RRMS組治療后血清和腦脊液IL-17下降(P<0.01)，而IL-35升高(P<0.05)。RRMS組治療前血清中IL-17水平與IL-35水平呈負相關(guān)(r=-0.551,P=0.041)。結(jié)論 Th17/Treg表達的失衡與RRMS的發(fā)病有關(guān)，甲潑尼龍治療可使血清、腦脊液IL-17水平下降，IL-35水平升高，進而抑制炎性反應(yīng)。

多發(fā)性硬化；Th17細胞；Treg細胞；白細胞介素-17；白細胞介素-35

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕±硖攸c的自身免疫性疾病，其確切的病因及發(fā)病機制迄今尚不清楚。復(fù)發(fā)緩解型MS(relapsing remitting multiple sclerosis,RRMS)是MS最常見的類型，其發(fā)病與自身免疫有關(guān)。最近研究結(jié)果顯示，Th17/Treg細胞亞群比例和功能失衡對MS的發(fā)生、發(fā)展有重要意義[1]。白細胞介素-17(IL-17)由輔助T細胞17(helper-T cell type 17，Th17)分泌，與RRMS的自身免疫反應(yīng)有關(guān)[2]。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T lymphocyte,Treg)功能失活是RRMS發(fā)病的主要原因之一[3]。IL-35是至今發(fā)現(xiàn)的由Treg釋放的能阻止免疫應(yīng)答過度反應(yīng)的新型信號分子[4]。目前，Th17/Treg細胞相關(guān)炎性反應(yīng)因子在RRMS發(fā)病機制中的作用及甲潑尼龍對其影響的研究尚未見相關(guān)報道。本研究通過檢測RRMS患者血清、腦脊液中IL-17和IL-35的水平，并觀察甲潑尼龍治療對其表達的影響，旨在深入研究Th17/Treg細胞失衡在RRMS發(fā)病中的作用。

1 對象和方法

1.1 臨床資料 收集2009-03-2013-06在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院部、急門診就診的RRMS患者36例，符合McDonald診斷標準[5]，均為急性發(fā)作期，入院前3個月未使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。其中男性16例，女性20例，平均年齡(29.25±7.38)歲，入院時EDSS評分2.5～8.0分，平均(6.42±1.61)分，病程3個月到4年，平均(27.21±5.3)年。均有新發(fā)陽性體征和(或)癥狀，其中肢體無力15例，感覺異常10例，視力減退4例，共濟失調(diào)3例，兩種或兩種以上癥狀20例。頭顱MRI檢查均有新的增強病灶，剔除合并自身免疫性相關(guān)疾病、嚴重感染、高血壓、糖尿病、消化道潰瘍及慢性肝病或肝功能異?；颊?。

另選神經(jīng)系統(tǒng)非炎性疾病患者32例為對照組，包括偏頭痛患者23例，緊張性頭痛患者9例，其中男性 11例，女性12例，平均年齡(31.09±8.68)歲。本組患者頭顱CT或MRI正常；腦脊液常規(guī)、生化、細胞學(xué)正常，寡克隆區(qū)帶陰性。排除標準：(1)急、慢性感染；(2)合并其他自身免疫性疾??；(3)應(yīng)用非甾體類抗炎藥物者，或6個月內(nèi)接受免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素或其他免疫治療；(4)并發(fā)嚴重心、肝、腎功能不全。RRMS組和對照組在性別構(gòu)成和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究納入患者均簽署知情同意書，經(jīng)蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：RRMS組患者入院后予以甲基潑尼松龍1000 mg/d，3 d后減至500 mg，每3 d減一半減至30 mg時改為潑尼松35 mg口服，每周減5 mg至停藥。

1.2.2 標本采集和IL-13、IL-35測定：兩組患者分別于治療前(RRMS組本次復(fù)發(fā)后1周之內(nèi))、治療后2周時采靜脈血5 mL并留取腦脊液標本，直接分裝至0.5 mL EP管內(nèi)，-80℃冰箱凍存，采用ELISA法分別檢測血清、腦脊液中IL-17、IL-35水平，試驗步驟按照ELISA法試劑盒(武漢博士德試劑公司)進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗；兩組間比較采用兩個獨立樣t檢驗；IL-17與IL-35的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RRMS組治療前后IL-17、IL-35水平比較 RRMS組治療后血清和腦脊液IL-17水平較治療前下降(P<0.01)；而IL-35水平較治療前均升高(均P<0.05)。結(jié)果見表1。

2.2 兩組患者治療前IL-17、IL-35比較 RRMS組治療前血清、腦脊液IL-17水平均高于對照組(均P<0.01)，而IL-35水平均低于對照組(均P<0.05)。結(jié)果見表2。

2.3 RRMS組血清IL-17與IL-35的相關(guān)性分析 MS組治療前血清IL-17水平與IL-35水平呈負相關(guān)(r=-0.551，P=0.041)。

2.4 RRMS組治療前后EDSS評分比較 RRMS組治療后2周EDSS評分較治療前降低(4.15±0.76比6.42±1.6；t=2.31，P=0.041)。

3 討論

MS發(fā)病與自身免疫相關(guān)，Th17/Treg平衡對維持正常免疫應(yīng)答，防止自身免疫具有重要的意義。IL-17、IL-23、IL-21等是Th17細胞分泌的重要相關(guān)細胞因子[6]。Th17細胞功能亢進，Treg細胞功能低下，在MS發(fā)病中發(fā)揮重要作用，深入研究二者的平衡、失衡機制，對MS病理機制研究及診治具有重要價值。

表 1 RRMS組治療前后血清和腦脊液IL-17、IL-35水平比較

表 2 RRMS組治療前和對照組血清及腦脊液IL-17、IL-35水平比較

Th17主要是CD4+效應(yīng)性記憶性T細胞，活化后可以產(chǎn)生IL-17，是早期產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的炎性細胞因子[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性期RRMS患者與對照組相比血清和腦脊液中的IL-17水平明顯升高。IL-17可刺激成纖維細胞、內(nèi)皮細胞分泌各種細胞因子，如IL-6、IL-8、前列腺素E2、單核細胞化學(xué)趨化性蛋白-1和粒細胞集落刺激因子，還可促進補體C3等急性期反應(yīng)蛋白的產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[8-9]。IL-17、IL-23、IL-21、IL-6等細胞因子之間存在復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，它們相互作用、誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)RRMS患者經(jīng)激素治療后IL-17在血清和腦脊液中水平下降，表明甲潑尼龍可通過抑制Th17的分化，減少IL-17的產(chǎn)生以減輕炎性反應(yīng)，抑制神經(jīng)系統(tǒng)的損害，通過治療2周時其EDSS評分與治療前相比下降。

Treg在體內(nèi)執(zhí)行免疫抑制功能，限制過度及錯誤的免疫應(yīng)答，其功能低下，失去了對免疫炎性反應(yīng)的抑制作用是MS發(fā)病的主要原因，RRMS患者的Treg數(shù)量與功能較健康人均明顯下降。IL-35可顯著抑制Th17細胞的分化[10]，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)通過加速Th17細胞的分化促進前炎性反應(yīng)[11]。干擾素-γ(IFN-γ)阻止TGF-β誘導(dǎo)的Th17分化[12-13]。然而，IFN-γ可以被IL-35上調(diào)，因此IL-35在Th17的分化過程中有免疫抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)急性期RRMS患者血清和腦脊液中IL-35水平明顯低于對照組。FOXP3是Treg細胞的表面標志物[14],可能IL-35參與抑制FOXP3的表達使Treg細胞的免疫抑制功能下降，也可能與其下調(diào)INF-γ有關(guān)，這有待于進一步的研究。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，甲潑尼龍治療后RRMS患者血清和腦脊液中IL-35水平明顯升高，表明激素可以促進IL-35的表達，進而恢復(fù)Treg的功能達到抑制炎癥反應(yīng)的結(jié)果。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示RRMS患者血清和腦脊液IL17及IL-35水平在治療前后以及與神經(jīng)系統(tǒng)非炎性疾病患者比較發(fā)生了顯著變化。因此，炎性反應(yīng)可能是打破Th17/Treg平衡，Th17功能亢進、Treg功能低下的關(guān)鍵，提示Th17/Treg失衡與RRMS的發(fā)病密切相關(guān)。通過治療前與治療后2周的EDSS評分的比較，可見糖皮質(zhì)激素對RRMS急性期的治療有效。關(guān)于糖皮質(zhì)激素究竟是通過改善炎性環(huán)境促進Treg功能恢復(fù)，還是通過恢復(fù)Treg、抑制Th17的功能達到抑制炎性反應(yīng)，從而改善病情，或是兩者都有需要進一步研究。

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(本文編輯：時秋寬)

Expression of Th17/Treg cytokines in patients with relapsing remitting multiple sclerosis

LIXiaoling,ZHANGBo,YUChunmei,YANXiang,WANGManxia*.

*DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofLanzhouUniversity,LanzhouGansu730030,China

WANG Manxia，Email：wmx322@aliyun.com

Objective To investigate the role of T helper type 17 (Th17)and Treg-related cytokines interleukin-17(IL-17) and interleukin-35(IL-35) in relapsing remitting multiple sclerosis(RRMS) in the pathogenesis, and the affect of methylprednisolone to their expression.Methods We recruited RRMS patients and noninflammatory neurological controls, and detected the levels of IL-17 and IL-35 in serum and cerebrospinal fluid(CSF) with ELISA kit in both controls and RRMS patients before and after methylprednisolone treatment. Results Compared with the control group, the levels of IL-17 in serum and CSF in patients with RRMS were higher before treatment (P<0.01), and the levels of IL-35 in serum and CSF in patients with RRMS were lower before treatment (P<0.05). The levels of IL-17 in serum and CSF in patients of RRMS were lower after treatment than those before treatment (P<0.01), while the levels of IL-35 in serum and CSF were higher after treatment (P<0.05). Correlation analysis showed that IL-17 and IL-35 were negative correlated in the serum of RRMS before treatment(r=-0.551,P=0.041). Conclusions Th17/Treg expression imbalance is related to the pathogenesis of RRMS. Methylprednisolone treatment can decrease the levels of IL-17 in the serum and CSF, and elevate levels of IL-35 in the serum and CSF, thus methylprednisolone can inhibit the inflammatory response.

multiple sclerosis; T helper type 17; Treg-related; interleukin 17; interleukin 35

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.001

甘肅省科技支撐計劃項目(項目編號：1304FKCA086)

730030 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(李曉玲、閻湘、王滿俠)；蘭州大學(xué)第一醫(yī)院(張博)；甘肅省中醫(yī)院(于春梅)

王滿俠，Email:wmx322@aliyun.com

R744.5+1

A

1006-2963 (2015)03-0153-04

2014-10-13)