卞 丹，求璐慧，楊海龍

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035)

不同金屬離子和pH對(duì)白腐菌Ganoderma lucidum產(chǎn)漆酶的影響

卞 丹，求璐慧，楊海龍?

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035)

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度金屬離子，研究Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+等金屬離子的濃度和pH對(duì)白腐菌Ganoderma lucidum生產(chǎn)漆酶的影響．結(jié)果表明：Zn2+、Cu2+和Mn2+對(duì)G. lucidum生產(chǎn)漆酶有不同程度促進(jìn)作用，其中Cu2+的促進(jìn)作用最大，Mg2+在高濃度時(shí)促進(jìn)產(chǎn)酶，F(xiàn)e2+則抑制漆酶的生產(chǎn)；pH為5時(shí)最利于漆酶的生產(chǎn)，酶活可達(dá)到140 000 U/L．

白腐菌；金屬離子；pH；漆酶

漆酶（Laccase）是一種結(jié)合4個(gè)銅離子的多酚氧化酶，其中Cu2+與酶以配位體的形式結(jié)合．在催化反應(yīng)過(guò)程中，氧分子被還原為水，而漆酶從氧化底物分子中提取一個(gè)電子，使之形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，可自身結(jié)合或者相互偶聯(lián)，形成聚合物或偶聯(lián)物，此過(guò)程中不產(chǎn)生其他物質(zhì)[1]．漆酶可與多酚、木質(zhì)素、甾體等多種底物發(fā)生反應(yīng)[2]，故在木質(zhì)素降解、生物制漿與漂白、染料的脫色、生物監(jiān)測(cè)等方面有著廣泛的應(yīng)用[3-4]．漆酶主要分布于真菌、高等植物，在眾多生產(chǎn)漆酶的生物體中，白腐菌Ganoderma lucidum是最主要的生產(chǎn)者[1]．

目前，由于生產(chǎn)效率不高等原因，漆酶還未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，如何提高漆酶產(chǎn)量與活力等問(wèn)題尚在探索中．許多研究發(fā)現(xiàn)[5-7]金屬離子和pH對(duì)微生物產(chǎn)酶有重要影響，本研究以白腐菌Ganoderma lucidum WZ-32為生產(chǎn)菌，通過(guò)改變金屬離子濃度和pH來(lái)探究其對(duì)產(chǎn)酶的影響，以期優(yōu)化G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件，為漆酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 菌 種

供試白腐菌G. lucidum WZ-32為溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供，菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，4℃保存．

1.2 主要試劑與儀器

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（簡(jiǎn)稱ABTS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸錳、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為市售分析純．

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Mettler-Toledo SevenEasy pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；VS-840K-U潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）．

1.3 漆酶發(fā)酵液的制備

將白腐菌G. lucidum WZ-32接種于100 mL種子培養(yǎng)基（葡萄糖2%，玉米粉2%，豆粕1%，硫酸鎂0.075%，磷酸氫二鉀0.15%，水，pH自然），在28℃、165 r/min搖床培養(yǎng)5 d．將種子液按10%的接種量接種到150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中（葡萄糖1%，玉米粉2%，豆粕1%，花生殼2%，硫酸鎂0.075%，磷酸氫二鉀0.075%，磷酸二氫鉀0.075%，水，pH自然），在28℃、165 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d．發(fā)酵液常溫下濾紙過(guò)濾取其上清，適當(dāng)稀釋測(cè)定漆酶活性．

1.4 漆酶測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法[8]測(cè)定漆酶活力．反應(yīng)總體系3 mL，含0.1 mL稀釋酶液，1.9 mL pH=3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液和1.0 mL 0.5 mmol/L ABTS溶液．45℃水浴保溫3 min，于420 nm處測(cè)定吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值．每分鐘氧化1μmol底物所需要的酶量為1個(gè)酶活單位（U）．空白對(duì)照組中以蒸餾水代替酶液．

1.5 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入①本文實(shí)驗(yàn)所涉及濃度均為重量百分濃度(w/v).0.06%的不同金屬離子（Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+），搖床培養(yǎng)5 d測(cè)其酶活．

1.6 金屬離子濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中依次加入0、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%和0.1%的金屬離子（Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe2+），搖床培養(yǎng)5 d測(cè)其酶活．添加Mg2+時(shí)濃度分別為為0、0.025%、0.05%、0.075%、0.1%和0.125%．

1.7 pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

將滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)液pH依次調(diào)節(jié)到4、4.5、5、5.5、6、6.5、7和7.5，搖床培養(yǎng)5 d測(cè)其酶活．

2 結(jié)果與討論

2.1 不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

金屬離子對(duì)漆酶的影響是多方面的，離子種類、離子電荷數(shù)和離子濃度等都會(huì)對(duì)酶的活性產(chǎn)生不一樣的影響[9]．在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.06%的不同金屬離子，搖床培養(yǎng)5 d測(cè)其酶活，探究不同金屬離子對(duì)G. lucidum WZ-32產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

表1顯示，同等濃度下，Zn2+、Cu2+、Mn2+對(duì)產(chǎn)酶有不同程度的促進(jìn)作用．在這三者中，Cu2+對(duì)產(chǎn)酶影響最大，漆酶活力顯著提高，Mg2+和Fe2+對(duì)漆酶活性有些許抑制作用．

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，銅是漆酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成，因此它的存在能有效提高真菌漆酶的產(chǎn)量．Collins P. J.[10]和Galhaup C.[11]等學(xué)者認(rèn)為可能是銅離子能夠誘導(dǎo)漆酶基因轉(zhuǎn)錄合成蛋白，所以缺少和限制銅含量都會(huì)不利于漆酶的合成．Stajic M.等[12]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+和Mn2+對(duì)側(cè)耳屬的三種菌有不同的促進(jìn)作用．Zn2+、Cu2+、Mn2+易與漆酶芳香基上的羰基、羧酸殘基結(jié)合，改變漆酶中心離子的結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)激活作用[5]．Fe2+通過(guò)與底物催化氧化產(chǎn)物ABTS自由基的反應(yīng)來(lái)抑制漆酶的活力[13]．金屬離子作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和相關(guān)代謝物的合成有重要影響．

2.2 金屬離子濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同金屬離子及濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響見(jiàn)表2．

表2 不同金屬離子及濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

表2的結(jié)果顯示了不同金屬離子濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響，其中Zn2+、Cu2+和Mn2+對(duì)G. lucidum生產(chǎn)漆酶有不同程度促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+則抑制漆酶的生產(chǎn)．由表2可以看出，Zn2+在其濃度小于0.1%時(shí)，對(duì)產(chǎn)酶影響表現(xiàn)為促進(jìn)作用；且在濃度為0.06%時(shí)達(dá)到最大酶活，大約是對(duì)照組漆酶活性的2倍．Cu2+極大的促進(jìn)了漆酶的產(chǎn)量，當(dāng)培養(yǎng)基中Cu2+濃度為0.02%時(shí)漆酶活性最大，達(dá)42 014.35 U/L，大約是對(duì)照組漆酶活性的27倍，大大提升漆酶產(chǎn)量．因此在漆酶生產(chǎn)過(guò)程中可添加適量的Cu2+離子，以達(dá)到高產(chǎn)的效果．Stajic M.等[12]的研究也表明Cu2+的不同濃度使側(cè)耳屬三種菌種的漆酶活性得到不同程度的提高．實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)不同的Mn2+濃度對(duì)漆酶產(chǎn)量的促進(jìn)作用不明顯，較高濃度的Mg2+可促進(jìn)G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶．Fe2+對(duì)漆酶的生產(chǎn)情況具有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用隨著濃度的增加而輕微增強(qiáng)．

2.3 pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

漆酶是蛋白質(zhì)，并且是兩性電解質(zhì)，因此其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的解離程度受H+的影響，即培養(yǎng)基的pH對(duì)產(chǎn)酶有明顯影響．研究表明[14]過(guò)多的H+會(huì)影響漆酶活性中心結(jié)合集團(tuán)的解離狀態(tài)，從而使得漆酶不能催化底物，還可能影響底物的解離狀態(tài)，使底物不能與漆酶結(jié)合，從而阻止催化反應(yīng)進(jìn)行．劉尚旭等[15]對(duì)糙皮側(cè)耳Ax3產(chǎn)漆酶條件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其最適pH為5.5．趙鳳霞等[9]對(duì)白腐菌Trametes pubescens MB89產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化探究，最終得出在不同底物影響下，產(chǎn)酶的最適pH不同．pH對(duì)漆酶活性的影響見(jiàn)圖1．

圖1 pH對(duì)漆酶活性的影響

圖1表明G. lucidum WZ-32產(chǎn)酶情況易受pH影響，且隨著pH變動(dòng)產(chǎn)酶變化較大．當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5，其產(chǎn)量最大，為140 000 U/L．當(dāng)pH在4.0 – 5.0之間時(shí)，漆酶產(chǎn)量隨著pH的增大而快速提高，而當(dāng)pH＞5.0時(shí)，漆酶產(chǎn)量隨著pH的增大而降低．這說(shuō)明初始的pH條件對(duì)G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶具有重要影響，適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件能促進(jìn)它的代謝作用，產(chǎn)生更多漆酶．

3 結(jié) 論

Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+等金屬離子對(duì)白腐菌G. lucidum WZ-32產(chǎn)酶影響不同，研究表明Zn2+、Cu2+和Mn2+對(duì)漆酶活性都有不同程度的促進(jìn)作用，其中Cu2+對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最大．當(dāng)培養(yǎng)基中Cu2+濃度為0.02%時(shí)，漆酶活力最大，為42 014 U/L．Mg2+在高濃度時(shí)促進(jìn)產(chǎn)酶，而Fe2+則完全抑制漆酶的生產(chǎn)，降低漆酶產(chǎn)量．此外，漆酶活性受pH變化影響較大，當(dāng)pH為5.0時(shí)，活性最大，達(dá)140 000 U/L，也說(shuō)明適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件更能促進(jìn)G. lucidum WZ-32生產(chǎn)漆酶．

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Effects of Diverse Metal Ions and pH on Laccase Production of Ganoderma Lucidum

BIAN Dan, QIU Luhui, YANG Hailong
(School of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)

This paper probes into the effects of metal ions with diverse concentration on laccase production in the submerged culture of Ganoderma lucidum via addition of Zn2+, Cu2+, Mn2+, Mg2+and Fe2+respectively in the fermentation media. The results indicate that the laccase production is accelerated at different degrees by the addition of Zn2+, Cu2+and Mn2+, among which Cu2+has the most promoting effect. While, Mg2+accelerates the laccase production at high concentration, but Fe2+has inhibitive effect on the laccase production. The effect of pH on the laccase production is also researched. When the pH value is set at 5, the enzyme activity reaches 140, 000 U/L, which is the best for the production of laccase.

Ganoderma lucidum; Metal ion; pH; Laccase

Q815

A

1674-3563(2015)02-0058-05

10.3875/j.issn.1674-3563.2015.02.009 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

(編輯：封毅)

2014-05-12

卞丹(1992- )，女，浙江慈溪人，研究方向：生物技術(shù)．? 通訊作者，yhl@wzu.edu.cn