呂琳+鄭晨琰+李宇濤+常帥+王超

摘 要：該研究探討了不同培養(yǎng)條件對(duì)Ceriporiopsis subvermispora NL-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)基的初始含水率為64%、接種量為12%、起始pH 6.0時(shí)，該菌株活力最好且漆酶產(chǎn)量高；在條件下培養(yǎng)10d，漆酶活力可達(dá)12.45 U/g干基，比優(yōu)化前提高了40%。

關(guān)鍵詞：蟲擬蠟菌；固態(tài)發(fā)酵；漆酶

中圖分類號(hào) TQ925 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）08-0018-03

Abstract：Effect of culture conditions for the production of laccase by Ceriporiopsis subvermispora NL-4 were investigated in solid-state fermentation using the milled bamboo as main substrate.The results of single-factor test showed that the optimal culture conditions of the temperature，moisture of medium，inoulum volume and the initial pH were 30℃，64%，12% and 6.0.After the strain of C. subvermispora NL-4 was cultured for 10d growth under the conditions of the above parameters，the laccase activity was up to 12.45U/g dry medium，which was 40% higher than that under the primitive conditions.

Key words：Ceriporiopsis subvermispor；Solid-fermentation；Laccase

漆酶（laccase，p-diphenoloxidase，E.C.1.10.3.2）最初是從漆樹中獲得的，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，微生物源漆酶有了較大的發(fā)展。由于漆酶在多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的用途，對(duì)漆酶的需求日益增多[1-2]。但目前微生物產(chǎn)漆酶的產(chǎn)量仍不高[3]，培養(yǎng)期過長(zhǎng)導(dǎo)致染菌的可能性增大；漆酶的產(chǎn)量過低嚴(yán)重制約了其分離提取和純化[4]。采用農(nóng)林生物質(zhì)資源作為主要基質(zhì)，通過固態(tài)培養(yǎng)的方式探索漆酶的產(chǎn)生及其產(chǎn)量的提高，不但可以有效節(jié)約資源，降低生產(chǎn)成本，減少污染物的排放[5]；同時(shí)，與液體發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵更接近于自然界的生態(tài)環(huán)境，有利于菌株產(chǎn)酶[6-7]。蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispor）[8]是一類高產(chǎn)漆酶的白腐菌，本研究室對(duì)其進(jìn)行了菌株的誘變，獲得了一株漆酶產(chǎn)量明顯提高的菌株C. subvermispora NL-4[9]。因此，本研究以Ceriporiopsis subvermispora NL-4為發(fā)酵菌株，以竹粉為主要基質(zhì)，對(duì)該菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高漆酶產(chǎn)量和產(chǎn)酶效率[10]。

1 材料與方法

1.1 菌株 C. subvermispora NL-4，本研究室誘變選育獲得。

1.2 竹粉 竹粉，為毛竹（Phyllostachys pubescens）的加工剩余物，產(chǎn)自浙江臨安，烘干后過40目篩，干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 葡萄糖等均為國產(chǎn)分析純，購自杭州木木生物科技有限公司；ABTS，購于sigma公司；馬鈴薯等購于臨安浙皖農(nóng)貿(mào)城。

1.4 培養(yǎng)基 （1）PDA固體培養(yǎng)基（w/w）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，121℃滅菌20min[10]。（2）液體種子培養(yǎng)基（w/w）：酵母膏0.3%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，pH自然，121℃滅菌20min[10]。（3）固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：在250mL三角瓶中裝竹粉30g，含水率60%，121℃滅菌20min[10]。

1.5 固態(tài)發(fā)酵 參照王超等固態(tài)培養(yǎng)方法[10]。

1.6 生化參數(shù)的測(cè)定 （1）粗酶液制備及酶活測(cè)定：參照高恩麗等方法并改進(jìn)[11]。參照黃丹蓮等方法并改進(jìn)[12]。（2）生物量的測(cè)定：用氨基葡糖法，參照彭丹方法測(cè)定[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 C. subvermispora NL-4生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線 將液體種子以10%接種量接入固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，180r/min、28℃培養(yǎng)16d，漆酶產(chǎn)量和生物量如圖1。由圖1中菌體的生長(zhǎng)曲線顯示，在前4d之內(nèi)，菌體生長(zhǎng)較慢，之后在4～8d之內(nèi)菌體干重增加較快，呈現(xiàn)出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8～11d后保持基本穩(wěn)定[10]。酶活曲線顯示，C. subvermispora NL-4在固態(tài)發(fā)酵條件下，第5d才開始產(chǎn)酶，第12d漆酶活力達(dá)到最高，因此初步確定12d為后續(xù)發(fā)酵條件研究的培養(yǎng)時(shí)間。

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)C. subvermispora NL-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 將固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下，180r/min、恒溫培養(yǎng)12d后測(cè)漆酶產(chǎn)量，結(jié)果如圖2。圖2表明，培養(yǎng)溫度對(duì)C. subvermispora NL-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響較大，30℃時(shí)漆酶酶活達(dá)到最高，40℃時(shí)僅為最高酶活的39%，因此確定30℃為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最適培養(yǎng)溫度[10]。

2.3 起始含水率對(duì)C. subvermispora NL-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 將固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含水率分別調(diào)為44%、48%、52%、56%、60%、64%、68%和72%，180r/min、30℃培養(yǎng)12d后測(cè)漆酶產(chǎn)量，結(jié)果見圖3。圖3顯示，隨著培養(yǎng)基含水量的增加，漆酶活力也有提高，當(dāng)培養(yǎng)基的含水率64%時(shí)，漆酶活力最高。含水率繼續(xù)增加時(shí)，漆酶活力迅速下降。

2.4 起始pH對(duì)C. subvermispora NL-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 將固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在180r/min、培養(yǎng)基的含水率64%、30℃培養(yǎng)12d，測(cè)得的漆酶活力見圖4。圖4顯示，培養(yǎng)基pH會(huì)影響菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的活力，當(dāng)pH為6.0和6.5時(shí)，漆酶活力均很高，但pH再增加時(shí)，漆酶活力有較大下降。因此選擇起始pH為6.0。

2.5 接種量對(duì)C. subvermispora NL-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響 在固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別接入3%、6%、9%、12%、15%、18%的液體種子，培養(yǎng)基的含水率64%、起始pH 6.0、在180r/min、30℃培養(yǎng)12d，結(jié)果見圖5。圖5顯示，接種量不同，漆酶活力變化不明顯，當(dāng)接種量為12%時(shí)，漆酶活力最高。接種量增加到15%時(shí)，漆酶活力并無明顯提高反而下降，因此選擇12%為最適宜接種量。

2.6 C. subvermispora NL-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶曲線 以竹粉為固體發(fā)酵基質(zhì)，采用優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，即接種量12%、培養(yǎng)基起始含水率64%、起始pH6.0、在180r/min、30℃培養(yǎng)16d，研究C. subvermispora NL-4的菌絲體生物量以其漆酶活力的變化，如圖6。與優(yōu)化前相同，最初1～2d，菌體量增長(zhǎng)緩慢；而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體生物量逐漸增加；在第4～7d呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第9生物量最大；菌株在第5d產(chǎn)酶量開始有較明顯增加，第10d達(dá)到最高峰（12.45U/g干基）[10]。

3 結(jié)論

（1）對(duì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果為：培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)基起始含水率64%、起始pH6.0、接種量12%。

（2）按優(yōu)化后培養(yǎng)條件，C. subvermispora NL-4在第10d后其產(chǎn)漆酶活力達(dá)到最大值12.45 U/g干基，比優(yōu)化前提高了40%。

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