李瑞典 李中信（河北省任丘市畜牧水產(chǎn)局 062550）

J亞群禽白血病毒(ALV-J)是20世紀(jì)80年代末Payne等人首先從肉用型雞中分離鑒定出來的ALV新亞群[1]，在過去的幾十年中，ALV-J已經(jīng)在世界各地被報(bào)道[2,3,4,5]。我國(guó)于1999年首次從白羽肉雞中發(fā)現(xiàn)ALV-J[杜巖]，隨后在蛋雞中被報(bào)道[6]，由于世界范圍內(nèi)的白血病凈化進(jìn)程的成功，在中國(guó)的白羽肉雞和蛋雞中出現(xiàn)ALV-J的可能性大大減小。然而，最近ALV-J的感染在中國(guó)地方品系雞群中不斷被報(bào)道[7,8,9]。

本文報(bào)道了一例ALV-J在山東黃羽肉雞中的感染的病例。我們發(fā)現(xiàn)這株毒株與之前在白羽肉雞和美國(guó)分離株親緣關(guān)系非常近。因此，一些有效的預(yù)防和凈化措施需要盡快制定。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，按照常規(guī)方法制備。SPF雞胚購(gòu)自濟(jì)南SPAFAS。

1.2 病雞來源 2014年3月，山東某黃羽肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)腫瘤發(fā)病率升高，對(duì)死亡雞剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟和脾臟腫大并布滿白色腫瘤結(jié)節(jié)。

1.3 抗體檢測(cè) 采集送檢雞只血清，參照試劑盒說明書分別用IDEXX公司ALV-J、ALV-A/B和REV的抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行抗體檢測(cè)。對(duì)于ALV-J抗體：如果S/P值小于等于0.6，樣品為陰性；如果S/P值大于0.6，樣品為陽(yáng)性；對(duì)于ALV-A/B抗體：如果S/P值小于等于0.4，樣品為陰性；如果S/P值大于0.4，樣品為陽(yáng)性；對(duì)于REV抗體：如果S/P值小于等于0.5，樣品為陰性；如果S/P值大于0.5，樣品為陽(yáng)性。

1.4 病毒分離與鑒定 無菌采集送檢雞只抗凝血，取血漿接種于已長(zhǎng)成單層長(zhǎng)至70%～80%的CEF細(xì)胞。接種血漿后37℃孵育2～3h后棄掉上清液，無菌PBS緩沖液漂洗2次，換為1%細(xì)胞維持液。傳3代后，分別取100ul細(xì)胞培養(yǎng)上清用AvianLeukosisVirusAntigenTestKit檢測(cè)ALV群特異性抗原p27。對(duì)于細(xì)胞，固定液(丙酮:乙醇=3:2)固定后分別使用針對(duì)MDV、REV、ALV-J和ALV-A/B的單抗或單因子血清進(jìn)行IFA鑒定，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的ALV基因組序列，用Premier5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)引物（表1），擴(kuò)增包含整個(gè)env基因。引物由華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.6 目的片段的擴(kuò)增 將病毒分離為陽(yáng)性的血漿樣品用RNA提取試劑盒(按照OMEGA公司的RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行)提取病毒粒子基因組RNA，應(yīng)用寶生物兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(Takara Bio,Shiga,Japan)，將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，切下目的條帶并用膠回收試劑盒回收。將回收的DNA連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。將三個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序。應(yīng)用軟件DNAstar Lasergen7.1將分離株 env基因編碼的gp85和gp37氨基酸序列分別與不同亞群毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性比較，以確定分離病毒的亞群分類。同源性比較使用ClustalW Method。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測(cè)結(jié)果 對(duì)血清檢測(cè)抗體表明，REV抗體呈陰性；ALV-A/B抗體為陰性；ALV-J抗體為陽(yáng)性(表2)。

表2 病雞的抗體結(jié)果

圖1 接種病雞血漿的CEF細(xì)胞針對(duì)ALV-J的IFA檢測(cè)結(jié)果 (200倍)

2.2 病毒分離和鑒定結(jié)果 病毒分離結(jié)果表明，1份樣品的細(xì)胞培養(yǎng)上清p27為陽(yáng)性；該樣品針對(duì)ALV-J的IFA均為陽(yáng)性(圖1)，說明分離到一株ALV-J。取該樣品的血漿進(jìn)行RT-PCR測(cè)序，將該分離株命名為SD14HY01。所有樣品針對(duì)MDV、REV和ALV-A/B的IFA均為陰性，說明不存在MDV、REV和ALV-A/B的混合感染情況。

2.3 進(jìn)化樹分析 將SD14HY01的env基因與8株國(guó)際參考株和另外16株從中國(guó)白羽肉雞中分離到的參考株比較。結(jié)果顯示，SD14HY01與參考株在gp85氨基酸序列上高度同源，gp85氨基酸同源性介于84.6.1%～96.4%之間。根據(jù)gp85的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出(圖2)，SD14HY01與2013年從某地方肉用型雞以及2006年從中國(guó)黃羽肉雞中分離到毒株親緣關(guān)系較近。并且和中國(guó)白羽肉雞HN0001株以及美國(guó)株6803在同一個(gè)分支上。

3 討論

（1）盡管距離ALV-J第一次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)僅僅過去了20多年[1]，該病毒在它的致病性和抗原性上出現(xiàn)了迅速演變。作為世界第二大肉雞生產(chǎn)商，中國(guó)在1999年之前沒有ALV-J感染的報(bào)道[10]。在21世紀(jì)，國(guó)際種雞場(chǎng)對(duì)ALV-J已經(jīng)實(shí)施了不同程度的進(jìn)化。在中國(guó)的白羽肉雞和蛋雞中出現(xiàn)ALV-J可能性大大減小。然而，最近ALV-J在中國(guó)地方品系雞中的感染變得越來越嚴(yán)重。有許多關(guān)于ALV-J在中國(guó)地方品系雞包括黃雞中感染的報(bào)道[7,9]。盡管之前有零散的出現(xiàn)，本文報(bào)道了一例山東地區(qū)黃羽肉雞中有ALV-J的感染病例。（2）中國(guó)地方品系雞品種的多樣性和它們生長(zhǎng)性能的不同給ALV-J的出現(xiàn)和變異提供了一個(gè)得天獨(dú)厚的環(huán)境。同時(shí)，不同品系雞的混合飼養(yǎng)以及使用相同的孵化器加速了ALV-J的水平傳播[11]。這些條件導(dǎo)致了ALV-J的多樣性，使得ALV-J的感染變得更加復(fù)雜和多樣化。（3）進(jìn)化樹分析顯示本文分離的這個(gè)毒株與從美國(guó)白羽肉雞中的分離株6803以及在2000年從河南的中國(guó)父母代的白羽肉雞中分離代的HN0001有密切聯(lián)系(圖2)。進(jìn)化樹分析還表明本文的這株毒株可能與從廣州黃雞中分離到的毒株擁有一個(gè)共同的祖先。美國(guó)株4817與8株中國(guó)分離株很可能擁有一個(gè)共同的祖先[12]。先前的研究發(fā)現(xiàn)從中國(guó)地方品系雞黃雞中分離的GD0512株與2000年在一個(gè)父母代白羽肉雞中分離的HN0001株同源性最近。另外5株從黃雞中分離到的病毒與HN0001株和從白羽肉雞中分離到的美國(guó)株0661關(guān)系也很近[9]。因此，我們推測(cè)中國(guó)地方品系雞中ALV-J的感染可能是由于90年代一些地方品系雞公司與白羽肉雞的雜交育種實(shí)踐。在接下來的培育過程中，并沒有對(duì)感染有ALV-J的雞凈化，從而導(dǎo)致更加嚴(yán)重的感染。更嚴(yán)重的是，黃雞與純地方品系雞共同飼養(yǎng)在同一個(gè)雞場(chǎng)，甚至共用孵化器，這可能導(dǎo)致了該純地方品系雞的感染。

本研究鑒定了一例山東地區(qū)黃羽肉雞中ALV-J的感染，同時(shí)對(duì)該毒株的進(jìn)化做了一定的分析，發(fā)現(xiàn)很可能是由于雜交育種而感染。所有的這些證據(jù)表明中國(guó)地方品系雞感染ALV-J需要得到更進(jìn)一步的重視。

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