呂 峰， 于 洋， 梁 棟， 李兆明， 尤 偉， 張 斌△

PTPN14對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響＊

呂 峰1， 于 洋1， 梁 棟1， 李兆明2， 尤 偉1， 張 斌1△

1河南省人民醫(yī)院（鄭州大學(xué)人民醫(yī)院）乳腺外科，鄭州 450003
2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，鄭州 450052

目的 探討蛋白酪氨酸磷酸酶14（PTPN14）對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。方法 首先在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中建立穩(wěn)定高表達(dá)PTPN14的細(xì)胞系，并通過(guò)RT-PCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定；然后通過(guò)RNA干擾技術(shù)靶向抑制蛋白表達(dá)，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、噻唑藍(lán)（MTT）法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、BrdU細(xì)胞摻入實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體外成瘤實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)PTPN14對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 通過(guò)在mRNA和蛋白水平的檢測(cè)，證實(shí)高表達(dá)PTPN14的MCF-7穩(wěn)定細(xì)胞系建立成功。MTT法結(jié)果表明，培養(yǎng)第5天時(shí)高表達(dá)PTPN14組的MCF-7細(xì)胞數(shù)約為對(duì)照組的60%（P＜0.05）；細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組比較，高表達(dá)PTPN14的MCF-7細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)第3、4、5天時(shí)明顯減少（P＜0.05）；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和高表達(dá)PTPN14組的克隆數(shù)分別為（125±25）個(gè)和（62±13）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，低表達(dá)內(nèi)源性PTPN14將明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。進(jìn)一步的裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)PTPN14組的腫瘤體積僅為對(duì)照組的1／5（P＜0.05）；對(duì)照組和PTPN14組的腫瘤重量分別為:（0.6±0.2）g和（0.2± 0.1）g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 高表達(dá)PTPN14抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。

蛋白酪氨酸磷酸酶14； 細(xì)胞增殖； 乳腺癌

非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶14（tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 14，PTPN14）是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶超家族的成員，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞周期和腫瘤發(fā)生等過(guò)程。但是，PTPN14在乳腺癌中的具體功能并不完全清楚。本研究以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為對(duì)象，探討PTPN14對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7由本實(shí)驗(yàn)室保存（購(gòu)自ATCC公司）；RNA抽提試劑、RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4DNA連接酶、PCR產(chǎn)物分子量標(biāo)準(zhǔn)、Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、高保真TaqDNA聚合酶為北京Tiangen公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液及新生牛血清購(gòu)自Hyclone公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）及5-溴-2-脫氧尿嘧啶（BrdU）購(gòu)自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

從正常人乳腺組織文庫(kù)中利用RT-PCR方法擴(kuò)增出全長(zhǎng)PTPN14基因的cDNA，將其經(jīng)過(guò)酶切剪接后插入質(zhì)粒pcDNA4中，構(gòu)建出含有PTPN14全長(zhǎng)的高表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4-PTPN14。重組質(zhì)粒經(jīng)上海英駿（Invitrogen）公司測(cè)序，檢測(cè)重組的pcDNA4-PTPN14質(zhì)粒中是否有缺失或突變以及目的基因插入是否正確，有無(wú)框移等。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)定細(xì)胞系建立

采用乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清的DMEM，培養(yǎng)條件為5%CO2，溫度為37℃。第1天，胰酶消化后種植細(xì)胞于6孔板中，每孔約5×105個(gè)；第2天，待細(xì)胞長(zhǎng)至大約90%融合時(shí)開(kāi)始行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。首先，將質(zhì)粒pcDNA4-PTPN14及對(duì)照空質(zhì)粒pcDNA4和轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine用Opti-MEM稀釋?zhuān)靹蚝笫覝胤胖? min，然后再將二者混合，室溫放置20min后均勻加至6孔板中。2d后更換培養(yǎng)液并加入終濃度為50 μg／mL的篩選抗生素（zeocin）。利用zeocin繼續(xù)篩選2周，最后通過(guò)RT-PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鑒定PTPN14是否高表達(dá)，并最終得到穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系。

1.4 RNA干擾技術(shù)靶向抑制蛋白表達(dá)

由廣州銳博公司設(shè)計(jì)3條靶向序列不同的si RNA。siRNA的轉(zhuǎn)染步驟如下:轉(zhuǎn)染前1d將乳腺癌MCF-7細(xì)胞種植于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至大約30%融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用無(wú)血清培養(yǎng)液分別稀釋siRNA和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體，混勻后置室溫下5min；然后將二者混勻置于室溫20min，最后均勻加入6孔板中，后置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，所有的實(shí)驗(yàn)用品如EP管、槍頭都經(jīng)過(guò)DEPC水處理以去除RNA酶污染。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將上述穩(wěn)定表達(dá)PTPN14及空白對(duì)照的MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將其種植于96孔板中（每孔5.0×103個(gè)），混合均勻后置于培養(yǎng)箱中待用。24h后取出，每孔加入20μL濃度為5 mg／mL的MTT試劑，然后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。最后取出細(xì)胞棄去上清，每孔加入150μL二甲亞砜（DMSO），室溫下置于搖床上20min混勻，后于酶標(biāo)儀上檢測(cè)相應(yīng)的每孔吸光度（A490nm）值，通過(guò)A490nm－細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果可間接反映細(xì)胞增殖率。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

將上述穩(wěn)定表達(dá)PTPN14及空白對(duì)照的MCF-7細(xì)胞胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將其種植于12孔板中（每孔1.0×104個(gè)），混合均勻后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以后于每天同一時(shí)間點(diǎn)取出細(xì)胞培養(yǎng)板，對(duì)每孔細(xì)胞進(jìn)行消化并計(jì)數(shù)，連續(xù)5d后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.7 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將上述穩(wěn)定表達(dá)PTPN14及空白對(duì)照的MCF-7細(xì)胞胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后種植于6孔板中（每孔2×103個(gè)），然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2周。在進(jìn)行細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)前先用PBS清洗3次，然后加入吉姆薩Giemsa染色液染色，室溫下20 min，然后用PBS徹底清洗殘留的Giemsa染色液，清洗時(shí)注意防止將細(xì)胞克隆沖掉，最后將細(xì)胞克隆置于空氣中干燥后計(jì)數(shù)每孔的單個(gè)細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.8 5-溴-2-脫氧尿嘧啶BrdU摻入實(shí)驗(yàn)

參照試劑盒使用說(shuō)明，將上述細(xì)胞種植于6孔板，細(xì)胞覆蓋率約為50%時(shí)，加入10μmol／L BrdU標(biāo)記培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育30min。取出6孔板棄去培養(yǎng)液，消化收集細(xì)胞后以70%的冰凍乙醇固定、－20℃過(guò)夜。第2天加入試劑盒提供的一抗（小鼠的抗BrdU抗體）室溫下作用2h，然后PBS洗3遍后加入二抗（帶FITC的抗小鼠的熒光抗體）室溫下0.5h，然后進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.9 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

取鼠齡為6周左右的無(wú)特定病原體級(jí)的雌性BALB／c-nu裸鼠10只，每只體重約20g。按實(shí)驗(yàn)需求分為2組，分別皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA4和穩(wěn)定高表達(dá)PTPN14的MCF-7細(xì)胞。將約1.0×106上述乳腺癌細(xì)胞注射于每只裸鼠皮下，然后繼續(xù)飼養(yǎng)2個(gè)月左右，期間定時(shí)觀測(cè)并記錄腫瘤的大小變化。腫瘤體積計(jì)算:用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑a和垂直方向最大直徑（b），腫瘤體積計(jì)算公式:V＝（a×b）2／2。最后在麻醉后斷頸處死成瘤的裸鼠，取出各組的腫瘤并進(jìn)行稱(chēng)重。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立PTPN14穩(wěn)定高表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系

通過(guò)轉(zhuǎn)染、篩選、檢測(cè)，成功建立穩(wěn)定高表達(dá)PT-PN14的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，結(jié)果如圖1所示。

圖1 PTPN14穩(wěn)定高表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系建立Fig.1 Establishment of breast cancer MCF-17cell line with PTPN14stable expression

2.2 MTT法以及細(xì)胞計(jì)數(shù)法結(jié)果

MTT結(jié)果所示:穩(wěn)定高表達(dá)蛋白PTPN14的乳腺癌MCF-7細(xì)胞在培養(yǎng)第3、5天時(shí)細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），第5天時(shí)約為對(duì)照組的60%（圖2A）；細(xì)胞計(jì)數(shù)法表明:與對(duì)照組比較，高表達(dá)PTPN14的MCF-7細(xì)胞數(shù)在第3、4、5天時(shí)明顯減少，在第5天時(shí)對(duì)照組和高表達(dá)PTPN14組的乳腺癌細(xì)胞數(shù)分別為（10.1±1.5）×104和（6.1±0.5）×104，高表達(dá)蛋白PTPN14明顯抑制細(xì)胞增殖能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）。

圖2 通過(guò)MTT法（A）及細(xì)胞計(jì)數(shù)法（B）檢測(cè)PTPN14對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 MTT（A）and cell counting（B）analysis of the effect of PTPN14on MCF-17cell proliferation

2.3 平板細(xì)胞克隆形成以及BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果

建立高表達(dá)PTPN14的穩(wěn)定細(xì)胞系后，檢測(cè)細(xì)胞形成克隆能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:空質(zhì)粒對(duì)照組的克隆數(shù)為（125±25）個(gè)；PTPN14高表達(dá)的細(xì)胞組克隆數(shù)僅有（62±13）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3A）。然后通過(guò)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)PTPN14對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，空質(zhì)粒對(duì)照組BrdU摻入率為（29.0± 5.1）%，而PTPN14高表達(dá)后BrdU摻入率降低為（15.0±4.3）%，細(xì)胞增殖能力降低約50%，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。

圖3 通過(guò)平板細(xì)胞克隆形成（A）以及BrdU摻入實(shí)驗(yàn)（B）檢測(cè)PTPN14對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Detection of the effect of PTPN14on MCF-17cell proliferation by colony formation assay（A）and Brdu incorporation assay（B）

2.4 低表達(dá)PTPN14蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)源性PTPN14的表達(dá)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:PTPN14siRNA組PTPN14蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照siRNA組（圖4）；細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)（圖5A）結(jié)果顯示:對(duì)照siRNA組和PTPN14siRNA組的細(xì)胞數(shù)在培養(yǎng)第4天時(shí)分別為（4.9±0.3）×104和（6.9±0.9）×104，第5天時(shí)分別為（6.5±1.1）×104和（9.5±1.0）×104，PTPN14siRNA組的MCF-7細(xì)胞數(shù)與對(duì)照siRNA組相比，在培養(yǎng)第4和5天時(shí)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示: PTPN14siRNA組的MCF-7細(xì)胞增殖率在第3、5天明顯高于對(duì)照siRNA組，第5天時(shí)約為對(duì)照siRNA組的（1.8±0.5）倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5B）。通過(guò)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低表達(dá)PTPN14對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖6所示:對(duì)照組siRNA和PTPN14siRNA組的BrdU摻入率分別為（22.0 ±3.2）%和（35.0±4.8）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 Western blot驗(yàn)證PTPN14在MCF-17細(xì)胞中低表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of the low expression of PTPN14in MCF-17cells

圖5 通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法（A）及MTT法（B）檢測(cè)低表達(dá)PTPN14對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Detection of the effect of downexpression of PTPN14on MCF-17cell proliferation by cell counting（A）and MTT assay（B）

2.5 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高表達(dá)PTPN14明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。圖7A為第7周時(shí)兩組所形成的腫瘤大小，PTPN14高表達(dá)組裸鼠的腫瘤明顯小于對(duì)照組。第7周時(shí)，對(duì)照組和PTPN14高表達(dá)組的腫瘤體積分別為（0.58 ±0.31）cm3、（0.10±0.09）cm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7B）；對(duì)照組和PTPN14高表達(dá)組的腫瘤重量分別為（0.6±0.2）g、（0.2±0.1）g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7C）。

圖6 通過(guò)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低表達(dá)PTPN14對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Detection of the effect of downexpression of PTPN14on MCF-17cell proliferation by BrdU incorporation assay

圖7 高表達(dá)PTPN14抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的成瘤能力Fig.7 Inhibitory effect of PTPN14overexpression on the tumorigenicity of breast cancer MCF-17cells

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率高，由于手術(shù)、化療及生物治療等手段的聯(lián)合應(yīng)用，乳腺癌的治療效果較前大為改善，但仍有部分患者易復(fù)發(fā)或產(chǎn)生耐藥，預(yù)后較差［1］。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)生機(jī)制，尋找探索新的治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值［2－3］。

PTPN14屬于蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶超家族，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及細(xì)胞周期等過(guò)程［45］。PTPN14的N末端含有一個(gè)FERM結(jié)構(gòu)域，與細(xì)胞的粘附和運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)［6－8］。此外，PTPN14的突變體與結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤相關(guān)［9－13］，表明它可能參與了這些腫瘤的發(fā)生過(guò)程，但它在乳腺癌中具體的作用尚不完全清楚。

本研究首先在乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中建立穩(wěn)定高表達(dá)PTPN14的細(xì)胞系，以用于后續(xù)的功能或機(jī)制研究。然后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，如RNA干擾技術(shù)靶向抑制蛋白表達(dá)、MTT檢測(cè)、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)以及BrdU摻入等，證實(shí)了高表達(dá)蛋白PTPN14明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。其機(jī)制可能是通過(guò)選擇性去磷酸化MAPK通路蛋白，使該蛋白活性喪失，在MAPK級(jí)聯(lián)通路中起到負(fù)性調(diào)控作用，以達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的［14－16］。進(jìn)一步的裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明，高表達(dá)PTPN14后腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制，其腫瘤的大小僅為對(duì)照組的1／3左右。因此，綜合以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為高表達(dá)蛋白PTPN14可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，其在乳腺癌中可能是一個(gè)潛在的抑癌蛋白。

在此基礎(chǔ)上我們將進(jìn)一步檢測(cè)PTPN14在乳腺癌中的表達(dá)，觀察其與腫瘤患者的臨床分期與分級(jí)是否相關(guān)，分析其能否作為判斷乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

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（2015-02-18 收稿）

Effect of PTPN14 on the Cell Proliferation of Breast Cancer Cells

Lv Feng，Yu Yang，Liang Dong et al
Department of Breast Surgery，Henan Provincial People’s Hospital（The People’s Hospital of Zhengzhou University），Zhengzhou 450003，China

Objective To explore the effect of PTPN14on the cell proliferation of breast cancer cells.Methods The PTPN14-overexpressing MCF-7cell line was established and confirmed by using RT-PCR and Western blot.Then the effect of PTPN14on the proliferation of MCF-7cells was evaluated by cell counting，MTT，colony formation，BrdU incorporation assay and xenograft tumor formation assay after inhibition of PTPN14protein expression with RNA interference technology.Results The MCF-7stable cell line overexpressing PTPN14were successfully established by confirming the high expression of PTPN14at mRNA and protein level.MTT assay showed that the cell number was decreased by at least 40%at the fifth day in PTPN14overexpression group compared to control group（P＜0.05）.Cell counting showed that the cell number was significantly decreased at 3，4and 5days of culture in PTPN14overexpession group compared with control group（P＜0.05）.In the colony formation assay，the colony number was（125±25）in control group and（62±13）in PTPN14overexpression group，with difference being statistically significant（P＜0.05）.On the contrary，knockdown of endogenous PTPN14promoted the proliferation of MCF-7 cells.In the xenograft tumor formation assay，the xenograft weight was（0.2±0.1）g in PTPN14overexpression group，significantly lower than in control group［（0.6±0.2）g，P＜0.05］.Conclusion Overexpression of PTPN14can inhibit the proliferation of breast cancer cells.

PTPN14； cell proliferation； breast cancer

R739.41，R730.261

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.010

＊河南省科技廳基金資助項(xiàng)目（No.132300410048）

呂 峰，男，1978年生，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，E-mail:fenglv1978＠gmail.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail:zhangbin841919＠gmail.com