朱雪欽等??

【摘要】目的：探討補(bǔ)陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：采用線栓法制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，給藥組給予補(bǔ)陽還五湯原方劑量的水煎液，每日一次，連續(xù)灌胃7d；模型組與假手術(shù)組均給予同體積生理鹽水。測定SOD、GST和GSH-PX活性以及血清中MDA含量。結(jié)果：補(bǔ)陽還五湯可以顯著提高腦缺血再灌注大鼠SOD、GST、GSH-PX的活性，明顯抑制MDA的生成。結(jié)論：補(bǔ)陽還五湯對腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，抗氧化作用是其發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 補(bǔ)陽還五湯；MCAO大鼠模型；SOD；GST；GSH-PX；MDA

【中圖分類號】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）01-0042-02

Abstract：Objective To investigate the protection and mechanism of Buyang huanwu tang on focal cerebral in rats. Methods Focal cerebral ischemia-reperfusion model was made with sutur-occluded method in rats.Dose group was given Buyang huanwu tang， Model group and Sham group were given physiological saline.Then they were given once a day for seven consecutive days.The volume of cerebral in farction， the level of MDA in serum， the activities of SOD 、GST and GSH-Px in serum were rileasured. Results Buyang huanwu tang could increase the activities of SOD、GST and GSH-Px in serum and decrease MDA level. Conclosion Buyang huanwu tang has significant protection again cerebral ischemia-reperfusion injury.This effect may be related to its antioxidant property.

Keywords： Buyang huanwu tang； Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury； SOD；GST；GSH-PX；MDA

補(bǔ)陽還五湯是中醫(yī)益氣活血法的經(jīng)典方，由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花七味藥組成。臨床廣泛用于缺血性腦血管疾病，對灌注的大鼠皮層及小腦中活性氧（ROS）的生成、對大鼠血管源性腦水腫的抗應(yīng)冠心病、心肌梗死及其他血栓栓塞性疾病均有作用[1]，可顯著抑制腦缺血/再激具有治療作用。大量研究顯示，補(bǔ)陽還五湯對抗腦缺血所致的氧化應(yīng)激損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用[2，3]。本文將采用線栓法制作大鼠腦缺血/再灌注（MCAO）模型，并通過測定SOD、GST和GSH-Px活性以及MDA的含量，著重觀察補(bǔ)陽還五湯經(jīng)典方在大鼠腦缺血/再灌注損傷中的抗氧化作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級雄性SD大鼠，體重250±20g，由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

12實(shí)驗(yàn)儀器VF3001全波長掃描多功能酶標(biāo)儀（美國）。

13藥物與試劑黃芪（批號：1203131，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；當(dāng)歸尾（批號：1203046，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；赤芍（批號：1203072，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公）；地龍（批號：1112207，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；川芎（批號：1203055，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；桃仁（批號：120201，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；紅花（批號：1203083，源和堂中藥飲片有限責(zé)任公司）；氯化鈉（批號： F20110307，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；SOD、GSH-Px和MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）；GST試劑盒（上海生工生物技術(shù)有限公司）。

14方法

141動(dòng)物模型制備采取線栓法制作大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注模型[4]。動(dòng)物術(shù)前禁食12h，自由飲水。用10%水合氯醛3ml/kg行腹腔注射麻醉。鈍性分離右側(cè)右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），并小心分離迷走神經(jīng)，分別電凝ECA分支枕動(dòng)脈和甲狀腺上動(dòng)脈。在距CCA分叉大約1cm處結(jié)扎ECA近心端，電凝遠(yuǎn)心端。用無創(chuàng)小動(dòng)脈夾夾閉CCA，在ECA殘端距CCA分叉3mm處剪一小口，將制備好的線栓經(jīng)ECA插入ICA，線栓頭端距CCA分叉處約18mm，此時(shí)進(jìn)線有輕微阻力，栓線正好插至顱內(nèi)的大腦前動(dòng)脈，堵住大腦中動(dòng)脈（MCA）開口，制成MCAO模型。造模后2h，以半劑量10%水合氯醛再次麻醉動(dòng)物，拔出線栓，結(jié)扎ECA殘端。術(shù)后20～25℃條件下飼養(yǎng)大鼠，自由進(jìn)食水。假手術(shù)組除不在頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓外，其余步驟與上述相同。

142分組與給藥將21只大鼠隨機(jī)分成3組，每組7只，分別為模型組、給藥組、假手術(shù)組。給藥組給予補(bǔ)陽還五湯煎劑原方劑量，黃芪120g，當(dāng)歸尾6g，赤芍5g，地龍3g，川芎3g，桃仁3g，紅花3g。用水煎煮兩次合并混勻。模型組與假手術(shù)組均給予生理鹽水。每日一次，連續(xù)給藥7d。

143SOD、GST、GSH-Px的活力測定大鼠于缺血再灌注24h后斷頭取腦，冰上分離缺血側(cè)大腦皮質(zhì)適量，在冰浴中勻漿，用09%生理鹽水制成10%的組織勻漿液。4000r/min離心10 min，取上清。采用WST-1方法測定腦組織中SOD活力，CDNB法測定GST活力，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定GSH-Px活力。

144MDA的含量測定按“143”中的方法獲得腦組織勻漿液，采用硫代巴比妥法測定腦組織中MDA含量。

15統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS170軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，組間差異用t檢驗(yàn)分析結(jié)果，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

模型組與假手術(shù)組比較，SOD的活力顯著降低（P<001），GST的活力顯著降低（P<001），GST的活力顯著降低（P<001），GSH-Px的活力顯著降低（P<001），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；補(bǔ)陽還五湯組與模型組比較，SOD的活力顯著提高（P<005），GST的活力顯著提高（P<005），GSH-Px的活力顯著提高（P<005），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組與假手術(shù)組比較，MDA含量顯著升高（P<001），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；補(bǔ)陽還五湯組與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組顯著降低MDA含量（P<005），其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

腦血管疾病以高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率己成為嚴(yán)重威脅人類生命與健康的主要疾病之一，隨著我國老齡化社會(huì)的到來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。腦血管疾病主要包括缺血性和出血性腦卒中，其中以缺血性腦卒中最常見，而大腦中動(dòng)脈（MCA）是人群腦缺血的多發(fā)部位。

超微補(bǔ)陽還五湯能明顯降低組織內(nèi)的血漿丙二醛（MDA）和增加超氧化物歧化酶（SOD）活性，并增強(qiáng)大鼠腦組織神經(jīng)生長因子（NGF）的表達(dá)[5]；加味補(bǔ)陽還五湯對8Hz 130dB次聲暴露下小鼠大腦過氧化水平及超微結(jié)構(gòu)具有改善作用[6]?；蛐酒治鲅a(bǔ)陽還五湯對局灶性腦缺血再灌注大鼠保護(hù)作用機(jī)制的研究顯示，該方可上調(diào)多種抗氧化酶的基因，包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST），谷胱甘肽過氧化物酶-1（Gpx-1）、硫氧還蛋白（Tdpx1）等[7]。大量研究顯示，補(bǔ)陽還五湯對抗腦缺血所致的氧化應(yīng)激損傷而具有神經(jīng)保護(hù)作用。自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷廣泛參與腦缺血性中風(fēng)的神經(jīng)病理機(jī)制。缺血性中風(fēng)發(fā)生時(shí)，神經(jīng)元由于失去氧和葡萄糖的供應(yīng)，不能維持其靜息電位而使得動(dòng)作電位發(fā)放，興奮性氨基酸異常釋放，過度增加的興奮性氨基酸又進(jìn)一步激活神經(jīng)元使之去極化，促使Ca2+大量內(nèi)流，Ca2+超載激活多種細(xì)胞酶，使自由基大量生成，造成神經(jīng)元應(yīng)激和死亡。自由基使膜脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞功能，且過多的自由基會(huì)造成神經(jīng)元持續(xù)而致命的損傷[8]。脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物（MDA）有很強(qiáng)的毒性和反應(yīng)性，它們可使脂質(zhì)過氧化在細(xì)胞膜系統(tǒng)蔓延導(dǎo)致細(xì)胞功能的破壞，所以測量MDA的含量被認(rèn)為是氧自由基損傷的重要指標(biāo)。在正常狀態(tài)下，機(jī)體ROS的產(chǎn)生和清除間存在著動(dòng)態(tài)的平衡，產(chǎn)生的自由基可被SOD、GSH-Px、GST等抗氧化酶清除，故測定抗氧化酶類的活性可以間接反映體內(nèi)清除自由基的能力變化。腦缺血再灌注時(shí)，機(jī)體ROS的生成過多，超過了抗氧化酶對它的清除，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷。腦缺血大鼠再灌注后，SOD、GSH-Px、GST活性顯著降低，MDA含量明顯升高，表明腦缺血再灌注期脂質(zhì)過氧化增加，機(jī)體抗氧化能力降低。本實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯能顯著提高SOD、GSH-Px、GST的活性，降低MDA的含量，表明補(bǔ)陽還五湯對腦損傷的保護(hù)作用與其抗氧化作用有關(guān)，藥物的作用機(jī)制可能為通過提高缺血再灌注腦組織SOD、GST、GSH-Px等抗氧化酶的活性，從而能清除氧自由基，起保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]姚暉，張繼平.補(bǔ)陽還五湯抗血栓實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13 （5）：95-97.

[2]李廷鳳，張娟，古力努爾，等.補(bǔ)陽還五湯對中風(fēng)大鼠腦組織中ros生成的抑制作用[J].生物物理學(xué)報(bào)，2003，19 （4）：441-447.

[3]周堅(jiān)，王靜新，蔡文智，等.補(bǔ)陽還五湯對大鼠血管源性腦水腫的抗應(yīng)激治療作用[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（3）：234-237.

[4]周宇，余涓，邱麗穎，等.褪黑素對大鼠急性腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19 （2）：194-196.

[5]蔡光先，尹天雷，李雅，等.超微補(bǔ)陽還五湯對腦缺血模型大鼠sod、Mda及ngf的影響[J].湖南中醫(yī)雜志，2007，23 （3）：90-91.

[6]范建中，楊俊峰， 陳景藻，等.加味補(bǔ)陽還五湯對8Hz 130dB次聲暴露下小鼠大腦過氧化水平及超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22 （4）：296-298.

[7]李鐵軍，邱彥，芮耀誠，等.基因芯片分析補(bǔ)陽還五湯對局灶性腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用機(jī)制[J].中國中藥雜志，2004，29 （6）：559-563.

[8]邵福源，王宇卉.分子神經(jīng)藥理學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2005.

（收稿日期：20140930）