張薇薇等

摘要：目的 以人工北蟲草、發(fā)酵蟲草菌粉和冬蟲夏草為研究對象，建立高效液相色譜（HPLC）特征圖譜。方法 采用超聲法提取蟲草中的水溶性成分，HPLC建立蟲草的特征圖譜。采用Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B），梯度洗脫（0～16 min，0%A；16～38 min，0%→10%A；38～58 min，10%→15%A；58～65 min，15%→0%A），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長260 nm，進(jìn)樣體積20 μL。運用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》，建立人工蟲草與天然蟲草HPLC特征圖譜，同時指認(rèn)了7個核苷類成分，并進(jìn)行比較研究。結(jié)果 本方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。以腺苷為參照峰，對11批冬蟲夏草、10批人工北蟲草和12批發(fā)酵蟲草菌粉進(jìn)行指紋圖譜分析結(jié)果顯示，其指紋圖譜相似度分別為0.889～0.982、0.781～0.980、0.502～0.970。結(jié)論 天然蟲草的指紋圖譜相似度較高，人工北蟲草和發(fā)酵蟲草菌粉指紋圖譜的相似度較低。本方法可作為評價人工蟲草和天然蟲草質(zhì)量的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：人工北蟲草；發(fā)酵蟲草菌粉；冬蟲夏草；指紋圖譜；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.025

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0092-05

Comparative Research on HPLC Characteristic Fingerprint of Cultured Cordyceps Militarise and Cordyceps Sinensis ZHANG Wei-wei， GONG Tao， HAN Dong-he （Beijing Clinical Medicines Institute， Beijing 100035， China）

Abstract：Objective To establish fingerprints of cultured Cordyceps Militaris， Cordyceps Sinensis and Fermental Cordyceps. Methods Water soluble components in Cordyceps Sinensis were extracted by ultrasonic method. The characteristic fingerprints were established by HPLC， with Agilent ZORBAX SB-Aq （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） as column and acetonitrile （A）-0.04 mol/L KH2PO4 （B） as mobile phase；gradient elution （0-16 min， 0%A；16-38 min， 0→10%A；38-58 min， 10%→15%A；58-65 min， 15→0%A）；the flow rate was 1.0 mL/min；column temperature was 25 ℃；the detection wavelength was 260 nm；the injection volume was 20 μL. The HPLC characteristic fingerprint of mycelium was developed， and the components of adenosine， uridine， guanosine， inosine， uracil， adenine and cordycepin were identified and compared. Results This method is with high degree of precision， good repeatability and stability. With adenosine as reference peak， similarity of 11 batches of Cordyceps Sinensis collected from different habitats， 10 batches of cultured Cordyceps Militarise and 12 batches of Fermental Cordyceps were 0.889- 0.982， 0.781-0.980 and 0.502-0.970， respectively. Conclusion There were good similarities between the standard fingerprint and each fingerprint of the eleven samples of Cordyceps Sinensis. There were low similarities between the standard fingerprint and each fingerprint of the ten samples of cultured Cordyceps Militaris and the twelve samples of Fermental Cordyceps. This method can be reference base for the evaluation of quality of cultured Cordyceps Militaris and Cordyceps Sinensis.

Key words：cultured Cordyceps Militaris；Fermental Cordyceps；Cordyceps Sinensis；fingerprint；HPLC

基金項目：北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展基金項目（JJ2009-14）

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis （Berk） Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，具“保肺益腎，止血化痰，已勞嗽”之功，主產(chǎn)于我國青海、西藏、四川、云南等省海拔3500～5000 m的高原高寒草甸。藥理研究表明，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等多種藥理作用[1]。近年來，從天然北蟲草中分離得到擬青霉Paecilomyces militaris的菌種，經(jīng)人工培養(yǎng)獲得人工北蟲草。采用天然蟲草真菌發(fā)酵法獲得人工蟲草菌粉。冬蟲夏草人工培養(yǎng)物制劑已廣泛應(yīng)用于臨床[2-6]。蟲草的物質(zhì)基礎(chǔ)豐富，含有氨基酸、核苷類、蟲草多糖、蟲草酸、甾醇類等。目前，冬蟲夏草及人工蟲草的質(zhì)量控制尚無統(tǒng)一方法。本研究建立蟲草高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法，通過分析人工蟲草和冬蟲夏草中水溶性成分的特征圖譜，研究人工蟲草和天然蟲草的成分差異及質(zhì)量狀況，為蟲草的質(zhì)量控制及進(jìn)一步開發(fā)利用蟲草資源提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），Solution工作站，SPD-20A 檢測器，Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；METTLER TOLEDO XP105 電子分析天平；Millipore Milli-Q Plus超純水系統(tǒng)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Anke TGL-16C高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

對照品腺苷（批號110879-200202）、肌苷（批號1406692-201104）、蟲草素（批號858-200202）購于中國食品藥品檢定研究院，尿苷（批號030M5309V）、鳥苷（批號120M1018V）、腺嘌呤（批號021M0181V）、尿嘧啶（批號080M0067V）購于SIGMA-ALDRICH；乙腈（HPLC Grade），美國Fisher Scientific；水為超純水。

冬蟲夏草藥材：冬蟲夏草1（西藏），冬蟲夏草2～5（購于北京白塔寺藥店），冬蟲夏草6～10（購于北京同仁堂藥店），冬蟲夏草11（青海），由北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所中藥化學(xué)室鑒定，符合2010年版《中華人民共和國藥典》要求。人工北蟲草：北蟲草1（北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所），北蟲草2（吉林蠶業(yè)研究所），北蟲草3（山東煙臺惠眾生物科技有限公司），北蟲草4～10（購于北京超市）。發(fā)酵蟲草菌粉：百令膠囊1～6[青海珠峰蟲草藥業(yè)有限公司，批號20120201 （0.5 g/粒）、20120202（0.5 g/粒）、20120203（0.5 g/粒）、20120201（0.2 g/粒）、20120202（0.2 g/粒）、20120203 （0.2 g/粒）]，百令膠囊7～12（杭州中美華東制藥有限公司，批號101041、091222、090425、100147、100551、110437）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流動相A為乙腈、B為0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液，梯度洗脫（見表1），檢測波長260 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取尿嘧啶、尿苷、肌苷、鳥苷、腺嘌呤、腺苷、蟲草素對照品，加0.5%磷酸溶液制成每1 mL分別含0.000 230 4、0.010 54、0.003 246、0.010 15、0.000 212 8、0.010 66、0.017 42 mg的混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取冬蟲夏草1、北蟲草1、百令膠囊[批號20120201（0.5 g/粒）]各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.5%磷酸溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.5%磷酸溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，12 000 r/min離心5 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白試驗

取0.5%磷酸溶液作為空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。對照品、供試品及空白溶液色譜圖見圖1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、3、5、10、20 μL注入液相色譜儀，在“2.1”項色譜條件下測定，記錄峰面積積分值。分別以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果見表2。

2.5.2 精密度試驗 取北蟲草1，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察儀器的精密度。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》對6次進(jìn)樣獲得的HPLC色譜圖進(jìn)行評價。結(jié)果表明，各色譜峰相似度在0.985～0.999之間，以腺苷作為參照峰，14個共有峰相對保留時間均RSD<0.34%，相對峰面積均RSD<2.82%，提示精密度良好。

A

1.尿嘧啶；2.尿苷；3.肌苷；4.鳥苷；5.腺嘌呤；6.腺苷；7.蟲草素

2.5.3 重復(fù)性試驗 取北蟲草1（6份），每份0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果表明，各色譜峰相似度在0.978～0.999之間，14個共有峰相對保留時間均RSD<0.26%，相對峰面積均RSD<3.78%，表明重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各色譜峰相似度在0.992～0.998之間，14個共有峰相對保留時間均RSD<0.48%，相對峰面積均RSD<3.49% ，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 特征圖譜的構(gòu)建及分析

2.6.1 人工北蟲草的特征圖譜 取10批北蟲草，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件分析、記錄10 批北蟲草的色譜圖，采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004 A）》對10批樣品HPLC色譜圖進(jìn)行多點校正，自動匹配（時間寬度為0.10），用中位數(shù)法生成對照圖譜R（即共有模式圖），計算相似度，建立北蟲草的特征圖譜，通過軟件計算，在檢測到的74個色譜峰中，確定了14個共有峰，占總峰面積的57.56%，相似度為0.781～0.980。10批人工北蟲草色譜圖及特征圖譜見圖2。

2.6.2 冬蟲夏草的指紋圖譜 以11批冬蟲夏草為研究對象，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄11批冬蟲夏草的色譜圖，在檢測到的104個色譜峰中，確定了23個共有峰，占總峰面積的72.38%，相似度為0.889～0.982，11批冬蟲夏草色譜圖及特征圖譜見圖3。

2.6.3 發(fā)酵蟲草菌粉的指紋圖譜 以12批百令膠囊（發(fā)酵蟲草菌粉）為研究對象，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄12批百令膠囊的色譜圖，在檢測到的124個色譜峰中，確定了39個共有峰，占總峰面積的81.87%，相似度為0.502～0.970，12批百令膠囊色譜圖及特征圖譜見圖4。

3 討論

按“2.3”項下方法制備供試品溶液，利用DAD檢測器進(jìn)行紫外全波長掃描，表明樣品在260 nm處吸收較強。對254、260、270 nm波長檢測的色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果以260 nm波長處檢出色譜峰最多，且峰面積均較大，基線平穩(wěn)，分離度較好。本著指紋圖譜確認(rèn)應(yīng)遵循信息量最大化的原則，以260 nm為檢測波長。

試驗考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.04 mol/L磷酸二氫鉀水溶液等系統(tǒng)作為流動相，結(jié)果顯示，乙腈-0.04 mol/L磷酸二氫鉀水溶液作為流動相，分離效果較好，峰形對稱，基線穩(wěn)定，最終選擇流動相為乙腈（A）-0.04 mol/L磷酸二氫鉀溶液（B），梯度洗脫。

試驗分別考察以水、20%甲醇、0.5%磷酸溶液為溶媒，結(jié)果表明，以0.5%磷酸作為提取溶媒，提取完全，提取溶液穩(wěn)定性好。在提取方式的選擇上，對比了超聲提取、熱回流提取2種方法，結(jié)果表明，超聲提取所得提取液的色譜峰數(shù)目較多，提取率高，操作簡便，較好體現(xiàn)了蟲草水溶性成分的構(gòu)成，故選擇超聲處理的方式提取蟲草中的水溶性成分進(jìn)行指紋圖譜研究。

對10批人工北蟲草和11批冬蟲夏草的HPLC圖譜數(shù)據(jù)分析處理結(jié)果顯示，在檢測到的133個色譜峰中，確定了5個共有峰，占總峰面積的11.52%，相似度為0.137～0.779，二者的指紋圖譜相似度很低，提示其有效成分的構(gòu)成存在較大差異。對12批百令膠囊和11批冬蟲夏草的HPLC圖譜數(shù)據(jù)分析處理結(jié)果顯示，在檢測到的169個色譜峰中，確定了14個共有峰，占總峰面積的40.49%，相似度為0.407～0.932。表明發(fā)酵蟲草菌粉與冬蟲夏草的指紋圖譜相似度高于人工北蟲草，表明發(fā)酵蟲草菌粉有效成分的構(gòu)成及含量更接近于天然蟲草。對10批人工北蟲草和12批百令膠囊的HPLC圖譜數(shù)據(jù)分析處理結(jié)果顯示，在檢測到的156個色譜峰中，確定了6個共有峰，占總峰面積的 16.80%，相似度為0.163～0.889，二者的指紋圖譜相似度較低，表明人工北蟲草和發(fā)酵蟲草菌粉有效成分的構(gòu)成及含量差異較大。

本試驗建立的蟲草HPLC特征圖譜為蟲草質(zhì)量評價提供了參考依據(jù)。人工蟲草與天然蟲草的指紋圖譜存在一定差異。不同產(chǎn)地冬蟲夏草之間的相似度較好，其中有效成分尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷及堿基類成分尿嘧啶和腺嘌呤的含量較高，質(zhì)量比較穩(wěn)定。人工北蟲草和發(fā)酵蟲草菌粉因菌種的差異、培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝不同，導(dǎo)致其指紋圖譜的相似度較低，特征圖譜中各色譜峰相對峰面積有較大差異，說明有效成分的含量差別較大，質(zhì)量不穩(wěn)定。比較人工蟲草與天然蟲草指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，北蟲草含有特征成分蟲草素，而冬蟲夏草和發(fā)酵蟲草菌粉中蟲草素的含量很低。

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（收稿日期：2015-03-08；編輯：陳靜）