唐林等

摘要：目的 建立抗癆清肺顆粒高效液相色譜（HPLC）特征圖譜。方法 采用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-1%醋酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～50 min，5%→15%乙腈；50～70 min，15%→25%乙腈；70～80 min，25%→40%乙腈；80～90 min，40%→65%乙腈；90～120 min，65%→95%乙腈），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，柱溫30 ℃；采用液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)進(jìn)行色譜峰組分的鑒定。結(jié)果 10批樣品相似度均>0.995，確立了13個(gè)共有特征峰，對(duì)其中10個(gè)共有峰進(jìn)行了來(lái)源歸屬，對(duì)其中8個(gè)共有峰進(jìn)行了成分鑒別。結(jié)論 建立的HPLC特征圖譜可用于抗癆清肺顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：抗癆清肺顆粒；特征圖譜；高效液相色譜法；液質(zhì)聯(lián)用

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.024

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）08-0088-04

HPLC Characteristic Chromatogram and HPLC-MS/MS Analysis of Kanglao Qingfei Granules TANG Lin1， LUO Chun-qing1， XIA Xin-hua1， ZENG Jian-guo2， LIU Yan-ke2 （1.School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.Changsha Central Hospital， Changsha 410004， China）

Abstract：Objective To establish HPLC characteristic chromatogram of Kanglao Qingfei Granules. Methods HPLC analysis of samples was performed on Kromasil C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， with acetonitrile-1% glacial acetic acid as the mobile phase of gradient elution （0-50 min， 5%→15% acetonitrile；50-70 min， 15%→25% acetonitrile；70-80 min， 25%→40% acetonitrile；80-90 min， 40%→65% acetonitrile， 90-120 min， 65%→95% acetonitrile）；the volume flow rate was 1.0 mL/min；detection wavelength was set at 290 nm；column temperature was 30 ℃. Chromatographic peaks were identified by HPLC-MS/MS method. Results The similarity degrees of 10 batches of samples were all greater than 0.995， and 13 chromatographic peaks were determined as common characteristic peaks， of which 10 peaks were confirmed in the source attribution and 8 peaks were identified in chemical component. Conclusion The established HPLC characteristic chromatogram can be used for the quality control of Kanglao Qingfei Granules.

Key words：Kanglao Qingfei Granules；characteristic chromatogram；HPLC；HPLC-MS/MS

抗癆清肺顆粒由百部、橘絡(luò)、矮地茶、黃精、玉竹等7味藥組成，源于長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要用于多耐藥性肺結(jié)核的治療。該制劑成分復(fù)雜，其中玉竹、黃精等含有較多皂苷及多糖類(lèi)成分[1-2]，橘絡(luò)、矮地茶等含有較多黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)等成分[3-4]，百部的主要活性成分為生物堿類(lèi)、糖類(lèi)等[5]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)該制劑的特征圖譜進(jìn)

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)-重大新藥創(chuàng)制（2013ZX10005004- 003-001）

通訊作者：夏新華，E-mail：xiaxinhua001@163.com

行研究，為抗癆清肺顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（N3000色譜工作站，SPD- 10Avp檢測(cè)器，LC-10ATvp泵）；質(zhì)譜儀（Agilent6530），配有Agilent1200液相色譜儀；SB-5200D超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率300 W，頻率50 Hz），XB-220A型電子分析天平（瑞士PRECISA）等。

抗癆清肺顆粒10批，實(shí)驗(yàn)室自制；橙皮苷（批號(hào)110721-201115），中國(guó)食品藥品檢定研究院；藥材飲片，購(gòu)自湖南三湘中藥飲片有限公司；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-1%醋酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（見(jiàn)表1），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，記錄時(shí)間120 min。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI源，一級(jí)全掃描，正負(fù)離子分別采集數(shù)據(jù)，霧化器壓力40 psi，毛細(xì)管電壓4 kV，干燥氣流量6 L/min，干燥氣溫度325 ℃，離子源溫度350 ℃。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.28 mg/mL的溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取本品4.0 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，水浴回流45 min，冷卻，稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5 各藥材溶液的制備

精密稱(chēng)取矮地茶、橘絡(luò)、黃精、玉竹等藥材粗粉適量，分別按“2.4”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～1.4%，相對(duì)保留峰面積RSD為0.2%～3.0%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品4.0 g，共6份，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，結(jié)果測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～0.7%，相對(duì)保留峰面積RSD為1.3%～3.0%，表明該法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.1%～1.0%，相對(duì)保留峰面積RSD為0.1%～2.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 特征圖譜建立及評(píng)價(jià)分析

2.7.1 特征圖譜的構(gòu)建與相似度評(píng)價(jià) 取樣品10批，分別按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄120 min的色譜圖。根據(jù)各樣品色譜圖所給出的峰數(shù)、峰面積積分值及相對(duì)保留時(shí)間，選取其中13個(gè)共有峰作為特征峰（見(jiàn)圖1）。采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》對(duì)10批樣品的HPLC色譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，即任選一樣品色譜圖作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配（時(shí)間窗寬度為0.10），用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜（共有模式圖），計(jì)算相似度。結(jié)果10批樣品色譜圖具有較高的相似度（>0.995），表明該制劑制備工藝穩(wěn)定。

2.7.2 共有特征峰的標(biāo)定 選擇橙皮苷峰（10號(hào)峰，保留時(shí)間為70.67 min±0.12 min）為參照峰（S峰），將各共有峰的保留時(shí)間與S峰的保留時(shí)間進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間。10批抗癆清肺顆粒共有特征峰的平均相對(duì)保留時(shí)間分別為1號(hào)峰0.09、2號(hào)峰0.10、3號(hào)峰0.13、4號(hào)峰0.23、5號(hào)峰0.29、6號(hào)峰0.31、7號(hào)峰0.50、8號(hào)峰0.53、9號(hào)峰0.94、10號(hào)峰1.00、11號(hào)峰1.16、12號(hào)峰1.25、13號(hào)峰1.33。

2.7.3 共有特征峰峰面積比 以橙皮苷峰（S峰）峰面積為1，計(jì)算各共有特征峰的峰面積與S峰峰面積的比值（相對(duì)峰面積）。結(jié)果10批抗癆清肺顆粒共有特征峰的平均相對(duì)峰面積分別為1號(hào)峰0.06、2號(hào)峰1.27、3號(hào)峰0.98、4號(hào)峰0.07、5號(hào)峰0.30、6號(hào)峰0.11、7號(hào)峰0.05、8號(hào)峰0.11、9號(hào)峰0.28、10號(hào)峰1.00、11號(hào)峰0.09、12號(hào)峰0.01、13號(hào)峰0.01。其中，2、3號(hào)峰與10號(hào)峰峰面積均占總峰面積的20%以上。

2.7.4 共有特征峰的辨識(shí)與歸屬 取橙皮苷對(duì)照品溶液及矮地茶、橘絡(luò)、玉竹、黃精、百部等藥材溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將各對(duì)照品、藥材圖譜與供試品特征圖譜進(jìn)行比較（見(jiàn)圖2），通過(guò)考察各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰形等，對(duì)供試品特征圖譜的共有峰進(jìn)行辨識(shí)與歸屬。結(jié)果表明，1、3、5～7、9～12號(hào)峰的專(zhuān)屬性較強(qiáng)，其中1、5號(hào)峰為矮地茶的特征峰，3號(hào)峰為黃精的特征峰，6、7號(hào)峰為百部的特征峰，13號(hào)峰為玉竹的特征峰，9～12號(hào)峰為橘絡(luò)的特征峰群，可用于該制劑中上述藥材的定性鑒別；2、4、8號(hào)峰未找到歸屬，可能為該制劑在制備過(guò)程形成的新組分。

2.7.5 共有特征峰成分分析 按照上述色譜和質(zhì)譜條件，對(duì)供試品溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。根據(jù)各色譜峰在正離子模式或負(fù)離子模式下獲得的一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子（[M+1]+、[M+Na]+、[M-1]-）及其二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子所提供的信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[6-13]對(duì)特征圖譜中8個(gè)共有特征峰所表征的成分進(jìn)行推測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本試驗(yàn)考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-1%醋酸不同流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)特征圖譜的影響，結(jié)果以乙腈-1%醋酸流動(dòng)相系統(tǒng)分離度好，基線平穩(wěn)。分別在205、230、254、275、296、290、312 nm對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在290 nm處，基線平穩(wěn)，峰形良好，峰數(shù)較多，故選擇290 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)還分別考察了不同提取溶媒（無(wú)水乙醇、甲醇、80%甲醇、60%甲醇、80%乙醇）對(duì)樣品特征圖譜的影響，結(jié)果表明，以甲醇作為提取溶媒時(shí)，峰形和峰數(shù)均能得到滿意的效果。同時(shí)，分別考察了不同提取方法（超聲、水浴回流）對(duì)特征圖譜的影響，結(jié)果顯示，水浴回流提取更能充分溶出抗癆清肺顆粒中的有效成分，故采用回流提取45 min作為供試品溶液的制備方法。

在各批樣品的指紋圖譜中，橙皮苷保留時(shí)間居中，峰面積占總峰面積的22.43%，故確定橙皮苷（10號(hào)峰）為參比峰（S峰），用于相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積的計(jì)算。該特征圖譜共有峰有13個(gè)，其中黃精、玉竹、矮地茶、橘絡(luò)都能與相應(yīng)峰進(jìn)行定位，但還有3個(gè)峰未能進(jìn)行歸屬，其中2號(hào)峰吸收較強(qiáng)，可能為制劑在制備中形成的新組分。另外，該制劑中還有2味藥也未能找到歸屬（圖2中的藥材A、藥材B），可能與其在上述色譜條件下無(wú)明顯色譜峰有關(guān)。

本研究采用HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)該制劑特征圖譜中8個(gè)共有峰進(jìn)行了成分推測(cè)，使特征圖譜在該制劑質(zhì)量控制中的針對(duì)性更強(qiáng)。目前，在中藥制劑質(zhì)量控制中應(yīng)用最多的是采用HPLC對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，很難全面控制其質(zhì)量，同時(shí)可供含量測(cè)定的對(duì)照品也有限[14]。而特征圖譜的應(yīng)用則能比較全面地控制其質(zhì)量，同時(shí)能體現(xiàn)中藥復(fù)方多組分多靶點(diǎn)發(fā)揮療效的特點(diǎn)[15]。另外，特征圖譜能同時(shí)鑒別復(fù)方制劑中的多種成分，專(zhuān)屬性強(qiáng)，因此可用于中藥復(fù)方制劑多味中藥的同時(shí)定性分析。

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（收稿日期：2015-03-19；編輯：陳靜）