肖子曾等

摘要：目的 觀察六味地黃湯對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）及脂肪組織磷酸二酯酶3B （PDE3B）的影響，探討其改善2型糖尿病的作用機(jī)制。方法 將80只SD大鼠隨機(jī)分為空白組和造模組，造模組采用高脂高糖喂養(yǎng)加腹腔注射STZ造模。將成模大鼠分為模型組、羅格列酮組、六味地黃湯組。各給藥組每日給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組和空白組給予等量生理鹽水，連續(xù)30 d。常規(guī)檢測大鼠空腹血糖（FBG），ELISA檢測大鼠血清cAMP和胰島素（INS）水平，Western Blot檢測脂肪組織PDE3B蛋白表達(dá)，實(shí)時熒光定量PCR檢測脂肪組織PDE3B mRNA表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，各給藥組大鼠FBG、FINS水平降低（P<0.05，P<0.01）；六味地黃湯組大鼠脂肪組織PDE3B蛋白及mRNA表達(dá)升高、血清cAMP濃度降低（P<0.01）。結(jié)論 六味地黃湯可上調(diào)脂肪組織PDE3B因子表達(dá)，降低cAMP濃度，這可能是其改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：六味地黃湯；2型糖尿??；胰島素抵抗；磷酸二酯酶3B；環(huán)磷酸腺苷；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.020

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0073-04

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on cAMP and PDE3B in Adipose Tissues of Rats with Type 2 Diabetes XIAO Zi-zeng1， ZENG Cheng-xi1， DAI Bing2， WU Qin-xuan1， CAO Lu-ting1， YANG Meng-lin1， ZHANG Jia-ni1 （1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.The First Affiliated Hospital to Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Liuwei Dihuang Decoction on cAMP and PDE3B in adipose tissues of rats with type 2 diabetes；To explore its mechanism. Methods Totally 80 SD rats were randomly divided into two groups：control group and molding group. Rats in the molding group established the type 2 diabetic models by feeding high sugar and fat diet combined with intraperitoneal injection of Streptozotocin. The successful modeling rats were divided into model group， Rosiglitazone group， and Liuwei Dihuang Decoction group. Administration groups were given relevant medicine for gavage， while model group and blank group were given the same amount of normal saline for 30 days. FBG levels were detected， and cAMP and INS levels were detected by ELISA. The protein expressions of PDE3B in adipose tissues were determined by Western blot. The mRNA expressions of PDE3B in adipose tissues were detected by RT-PCR. Results Compared with the model group， the FBG and INS levels in type 2 diabetic rats were reduced in Rosiglitazone group and Liuwei Dihuang Decoction group （P<0.05， P<0.01）. In Liuwei Dihuang Decoction group， the protein and mRNA expressions of PDE3B in the adipose tissues were higher， and cAMP levels were lower than the model group （P<0.01）. Conclusion Liuwei Dihuang Decoction can increase PDE3B expression， and decrease cAMP level， which may be one of the mechanisms for improving insulin resistance in type 2 diabetic rats.

Key words：Liuwei Dihuang Decoction；type 2 diabetes；insulin resistance；PDE3B；cAMP；rats

基金項目：湖南省自然科學(xué)基金（13JJ3096）；湖南省科技計劃一般項目（2010FJ4091）；湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金項目（11K046）；康爾佳藥業(yè)集團(tuán)糖尿病研究所支持項目（2014年）

通訊作者：戴冰，E-mail：db0223@163.com

2型糖尿病是一種多基因遺傳因素、環(huán)境因素綜合作用引起的內(nèi)分泌代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要包括β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗（IR）兩方面，而IR為該病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。環(huán)核苷酸依賴的磷酸二酯酶3B （phosphodiesterase 3B，PDE3B）屬于磷酸二酯酶（PDE）家族的亞型PDE3的成員之一[1]，通過對第二信使cAMP水解，在調(diào)節(jié)胰島素抗糖原分解、抗脂解效應(yīng)和分泌等生理過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，導(dǎo)致IR發(fā)生的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)正是通過影響PDE3B的活性及表達(dá)而發(fā)揮作用[2]。六味地黃湯是改善2型糖尿病的經(jīng)典方劑，可以改善糖尿病發(fā)病過程中的葡萄糖代謝異常，調(diào)節(jié)血脂[3]。本研究采用ELISA檢測六味地黃湯對血清cAMP濃度的影響，采用Western blot和實(shí)時熒光定量PCR檢測六味地黃湯對脂肪組織PDE3B蛋白及mRNA表達(dá)的影響，探討其改善2型糖尿病的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠80只，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2011-0003，合格證號4304700293，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，分籠、無菌條件喂養(yǎng)，室溫20～25 ℃，自由進(jìn)食與飲水，每日12 h燈光照射。普通飼料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物部提供，高糖高脂飼料（普通飼料70%，豬油10%，蔗糖15%，牛膽酸鈉0.5%，膽固醇2.5%，食鹽2%），湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物部加工制作[4]。

1.2 藥物

六味地黃湯（熟地黃24 g，山萸肉12 g，山藥12 g，牡丹皮9 g，澤瀉9 g，茯苓9 g）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。稱取六味地黃湯方原藥材10劑，共750 g，先浸泡30 min，再煎2次，每次30 min，合并藥液后水浴濃縮為質(zhì)量濃度1.915 g/mL的六味地黃湯。羅格列酮鈉片，太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，批號10090198。

1.3 主要試劑

枸櫞、磷酸氫二鈉，臺山市化工廠有限公司；鏈脲佐菌素（STZ），Sigma 公司；水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；PDE3B antibody（sc-20793），美國Santa cruz公司；GAPDH antibody（60004-1-lg），美國Proteintech Group公司；ELISA檢測試劑盒（CK-E30620R），R&D公司；熒光定量PCR試劑盒、組織蛋白裂解液、引物和內(nèi)參GAPDH，長沙賽晶生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

穩(wěn)豪倍易型（ONETOUCH? UltraEasyTM）血糖儀及配套血糖試紙，強(qiáng)生（中國）醫(yī)療器材有限公司；MK3型酶標(biāo)分析儀（美國）；熒光定量PCR儀（型號7900HT），美國ABI公司；核酸蛋白分析儀（型號BioPhotometer plus）、小型冷凍離心機(jī)（型號centrifuge 5415R），德國Eppendorf公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（型號DYY-2C），北京六一儀器廠；Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)（型號ChemiDocXRS），美國Bio-Rad公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

80只SD雄性大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白組（6只）和造模組（74只），分別給予普通飼料和高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，所有動物禁食不禁水12 h，造模組大鼠腹腔注射1%STZ 45 mg/kg，空白組腹腔注射等體積枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液，注射STZ 72 h后斷尾取血檢測大鼠空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS），視FBG≥16.7 mmol/L[5]及胰島素敏感指數(shù)（ISI）下降者為造模成功[6]。

2.2 分組、給藥及取材

造模成功大鼠隨機(jī)分為六味地黃湯組、羅格列酮組、模型組，每組14只。六味地黃湯組和羅格列酮組分別按臨床等效劑量六味地黃湯6.75 g/（kg·d）、羅格列酮0.81 mg/（kg·d）灌胃，連續(xù)30 d。模型組、空白組予等體積蒸餾水，給藥劑量按60 kg成人與200 g大鼠體表面積折算。大鼠禁食10 h，測FBG后腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，解剖，腹主動脈取血，靜置1 h后分離血清，-20 ℃凍存待檢。取腹部脂肪組織，凍存于液氮中，置于-80 ℃冰箱中待用。

2.3 大鼠空腹血清胰島素水平、血清環(huán)磷酸腺苷含量測定

嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，用紫外分光光度法測定OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本FINS、cAMP含量，計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR=FINS×FBG÷22.5）、胰島素敏感性指數(shù)[ISI=Ln1/（FBG×FINS）]。

2.4 大鼠脂肪組織磷酸二酯酶3B蛋白表達(dá)水平測定

用含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIPA冰上將脂肪及肝組織經(jīng)勻漿和超聲粉碎后，靜置30 min， 4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。采用考馬斯亮藍(lán)法測總蛋白含量。取各組樣品50 μg總蛋白上樣于4%濃縮膠和8%分離膠中SDS-PAGE電泳，使樣品中蛋白質(zhì)分離，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將轉(zhuǎn)印膜置于裝有封閉液（5%脫脂奶粉溶液）的孵育盒中，4 ℃過夜。加入一抗（PDE3B一抗稀釋度為1∶1000，GAPDH一抗稀釋度為1∶5000），室溫孵育4 h，TBST沖洗3次，10 min/次，加入二抗（稀釋度均為1∶2000），孵育2 h，TTBS沖洗3次。超敏發(fā)光液A液和B液等量混合點(diǎn)于轉(zhuǎn)印膜上，ECL發(fā)光顯色。用Bio-Rad凝膠自動成像系統(tǒng)對圖中印跡區(qū)帶進(jìn)行相對定量分析。

2.5 大鼠脂肪組織磷酸二酯酶3B mRNA表達(dá)測定

每組取6只大鼠的脂肪標(biāo)本進(jìn)行mRNA檢測，采用Trizol法抽提大鼠脂肪總RNA，RT-PCR反應(yīng)依據(jù)Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)擴(kuò)增PDE3B所用引物見表1。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系中加入RNA 1 μg。核酸蛋白分析儀測定RNA量和純度。其中磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)采用SYBR? Premix Ex Taq?（Takara）試劑，在ABI 7900HT熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用Sequence Detection software 1.2.3軟件（Applied Biosystems公司）分析PCR過程各檢測樣本的Ct值，相對表達(dá)量用2?ΔΔCt進(jìn)行計算。

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3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用正態(tài)性檢驗(yàn)及方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 六味地黃湯對大鼠血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感性指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR明顯升高（P<0.01），ISI明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，六味地黃湯組、羅格列酮組大鼠FBG、FINS、HOMA-IR明顯降低（P<0.05，P<0.01），ISI值明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.2 六味地黃湯對大鼠血清環(huán)磷酸腺苷含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠cAMP含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清cAMP含量明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

4.3 六味地黃湯對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠脂肪組織磷酸二酯酶3B蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組PDE3B蛋白表達(dá)量明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，兩給藥組PDE3B蛋白表達(dá)量明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表4、圖1。

4.4 六味地黃湯對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠脂肪組織磷酸二酯酶3B mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠PDE3B mRNA相對表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，給藥組PDE3B基因相對表達(dá)量明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表5。大鼠PDE3B mRNA擴(kuò)增曲線和融解曲線見圖2。

5 討論

糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，乃素體陰虛、飲食不節(jié)等因素導(dǎo)致機(jī)體陰燥熱、氣陰兩傷、陰陽俱虛等病證，并以陰虛為本。六味地黃丸出自宋代錢乙所著《小兒藥證直訣》，是治療腎陰虛證的經(jīng)典方劑。目前在糖尿病的臨床治療上廣泛應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)研究表明，其在改善糖和脂質(zhì)代謝、改善IR方面具有一定作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯能降低2型糖尿病大鼠FBG及膽固醇、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇含量，升高高密度脂蛋白膽固醇含量，推測六味地黃湯干預(yù)2型糖尿病作用可能與其改善脂代謝有關(guān)[6]。

在胰島素信號傳導(dǎo)通路PI3K/Akt通路中，PI3K活化后可致細(xì)胞脂質(zhì)磷酸化而激活A(yù)kt，從而促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪及糖原合成，其功能缺陷可以導(dǎo)致IR[7]。PDE3B是其Akt的重要的生理底物之一，主要分布在細(xì)胞膜上，胰島素應(yīng)答時，Akt會從胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜，以激活PDE3B。PDE3B被激活后，隨即水解cAMP， cAMP又通過依賴蛋白激酶A（PKA）和不依賴PKA兩條通路發(fā)揮作用，最終參與對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪代謝的調(diào)控[8]。因此，PDE3B活性下降會導(dǎo)致胰島素誘導(dǎo)的PI3K/Akt通路受阻，這使脂肪對胰島素敏感性減弱，從而誘發(fā)IR，最終可能導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃湯可增強(qiáng)2型糖尿病IR大鼠胰島素敏感性，明顯促進(jìn)脂肪組織PDE3B的蛋白及mRNA表達(dá)，降低血清cAMP濃度。這與Nagaoka T等[9]研究的在糖尿病個體的脂肪組織中PDE3B表達(dá)下降，給予抗糖尿病藥物后可恢復(fù)正常的結(jié)論具有一致性。由此，我們推測六味地黃湯改善2型糖尿病IR大鼠的作用機(jī)制之一可能是通過上調(diào)脂肪組織中PDE3B因子的表達(dá)，從而促進(jìn)其被Akt磷酸化和激活，降低細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷cAMP水平，使PKA活性下降，最終導(dǎo)致貯存的TG水解減少及游離脂肪酸從脂肪細(xì)胞中釋放減少，從而減輕IR。胰島素PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路中的各個因子相互聯(lián)系相互影響構(gòu)成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙都可能導(dǎo)致IR。六味地黃湯可上調(diào)脂肪組織PDE3B因子表達(dá)，降低cAMP濃度，達(dá)到治療2型糖尿病的目的。

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（收稿日期：2015-01-16；編輯：華強(qiáng)）