楊李，王寶田，田克印，吳德，唐久來(lái)

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022)

新生兒高膽紅素血癥是新生兒時(shí)期最為常見(jiàn)的疾病，膽紅素具有神經(jīng)毒性，輕度升高，即可導(dǎo)致患兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷，達(dá)到一定濃度時(shí)，可發(fā)生核黃疸，導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)障礙、腦性癱瘓，智力低下等嚴(yán)重后遺癥［1］。目前高膽紅素動(dòng)物模型常見(jiàn)的有靜脈注射膽紅素溶液、或利用基因缺陷動(dòng)物模型Gunn鼠建立高膽紅素血癥模型，或利用磺胺類藥物促使腦組織膽紅素濃度升高［2－3］;然而，上述模型并非溶血導(dǎo)致黃疸，結(jié)合新生兒高膽紅素血癥發(fā)病機(jī)制，并沒(méi)有良好的模擬作用，本研究通過(guò)腹腔梯度注射鹽酸苯肼，建立溶血致高膽紅素血癥模型，并測(cè)定血、腦組織膽紅素、NSE等水平，對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇7日齡清潔級(jí)SD大鼠60只，體重19～22 g，其中雄性28只，雌性32只，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(皖)2011－002】提供。

1.2 材料

鹽酸苯肼 (phenylhydrazine hydrochloride)(阿拉丁公司，中國(guó))。鹽酸苯肼溶液配制［4］:避光稱取鹽酸苯肼0.5 g，溶于50 mL滅菌注射用生理鹽水中，配制成1%的鹽酸苯肼溶液;鹽酸苯肼0.75 g，溶于50 mL滅菌注射用生理鹽水中，配制成1.5%的鹽酸苯肼溶液;鹽酸苯肼0.25 g，溶于50 mL滅菌注射用生理鹽水中，配制成0.5%的鹽酸苯肼溶液。為保證在不同注射劑量下，注射總液體量相同，以上試劑均用0.22 μm過(guò)濾頭過(guò)濾除菌。

1.3 動(dòng)物模型的分組及建立

隨機(jī)分為4組，每組15只，分別以25、50、75 mg/kg三種濃度腹腔注射鹽酸苯肼，作為實(shí)驗(yàn)1、2、3組;對(duì)照組按體重注射等量滅菌注射生理鹽水，均連續(xù)兩天同一時(shí)間進(jìn)行注射。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)

建模48 h后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物均安樂(lè)死，取頸內(nèi)靜脈和頸總動(dòng)脈約0.5～0.75 mL血;Roche COBAS INTEGRA 800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽紅素和NSE水平，Abbott Cell－Dyn 3200血細(xì)胞分析測(cè)定全血血紅蛋白水平;同時(shí)機(jī)械剝離實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦組織，稱重后10倍體積冰醋酸制成均漿等體積，丙酮抽提，同樣采用生化儀測(cè)定腦組織膽紅素濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3，在建立模型后陸續(xù)出現(xiàn)皮膚灰暗、呼吸急促、活動(dòng)減少、攝食次數(shù)減少和尿色變深的情況，其中實(shí)驗(yàn)組2中的1只動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)組3中的2只動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡，但至取材尚未出現(xiàn)自發(fā)性出血現(xiàn)象;實(shí)驗(yàn)1組出現(xiàn)活動(dòng)、攝食減少，尿色輕度變深，皮膚灰暗現(xiàn)象較實(shí)驗(yàn)2、3組輕。腹腔注射生理鹽水對(duì)照組尚未出現(xiàn)上述情況，且無(wú)死亡情況發(fā)生。

2.2 血和腦組織膽紅素及血紅蛋白水平測(cè)定

與空白對(duì)照組相比，腹腔注射鹽酸苯肼的3個(gè)不同劑量的實(shí)驗(yàn)組血清總膽紅素、腦組織的膽紅素水平顯著升高(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3的膽紅素水平均大于實(shí)驗(yàn)組1(P＜0.05)，而實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05);3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的血紅蛋白水平均低于對(duì)照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3血紅蛋白水平均小于實(shí)驗(yàn)組1(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 血清神經(jīng)特異性烯醇化酶

與空白對(duì)照組相比，腹腔注射鹽酸苯肼的3個(gè)不同劑量的實(shí)驗(yàn)組血清神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)顯著升高(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3的NSE水平均大于實(shí)驗(yàn)組1(P＜0.05)，而實(shí)驗(yàn)組2和實(shí)驗(yàn)組3之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表1 血和腦組織膽紅素水平和血紅蛋白測(cè)定()Tab.1 Measurement of brain tissue and blood bilirubin，and hemoglobin concentrations

表1 血和腦組織膽紅素水平和血紅蛋白測(cè)定()Tab.1 Measurement of brain tissue and blood bilirubin，and hemoglobin concentrations

注:＊△#:三組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2、3組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)2、3組間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。Note.＊△#:There was a significant difference between the three experimental groups and the control group(P ＜0.05).There was a significant difference between experimental group 1 and experimental groups 2 and 3(P＜0.05).There was no significant difference between experimental groups 1and 2(P＞0.05).

腦組織膽紅素△Brain tissue bilirubin/nmol/g組別Groups血清膽紅素*Serum bilirubin/μmol/L 2.8±0.56 0.10±0.04 137.8±11.6血紅蛋白#Hemoglobin/g/L Experimental group 1實(shí)驗(yàn)組1(n=15) 31.5±5.8 5.25±0.41 61.5±8.1 Experimental group 2實(shí)驗(yàn)組2(n=14) 61.1±5.7 14.8±0.49 40.5±3.2 Experimental group 3實(shí)驗(yàn)組3(n=13) 63.1±7.0 14.91±0.51 41.2±2.6 Control group對(duì)照組(n=15)

表2 血清神經(jīng)特異性烯醇化酶測(cè)定()Tab.2 Measurement of serum NSE

表2 血清神經(jīng)特異性烯醇化酶測(cè)定()Tab.2 Measurement of serum NSE

注*:三組實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2、3組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)2、3組相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。Note. ＊△#:There was a significant difference between the three experimental groups and control group(P＜0.05).There was a significant difference between experimental group 1 and experimental groups 2 and 3(P＜0.05).There was no significant difference between experimental groups 1 and 2(P＞0.05).

組別Groups 血清神經(jīng)特異性烯醇化酶*/ng/mL Serum NSE

3 討論

動(dòng)物模型應(yīng)盡可能模擬出疾病的特點(diǎn)及病理生理機(jī)制。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用不同劑量膽紅素聯(lián)合脂多糖頸靜脈注7日SD齡大鼠方式建立動(dòng)物模型，結(jié)果顯示模型出現(xiàn)不同程度的皮膚黃染，1 h后皮膚黃染均出現(xiàn)減退，提示膽紅素在體內(nèi)存留時(shí)間過(guò)短，不能模擬高膽紅素持續(xù)損害的過(guò)程［5］。王曉麗等［6］以3日齡 SD新生大鼠為對(duì)象，進(jìn)行連續(xù)6次膽紅素注射，從而建立相對(duì)穩(wěn)定的高膽紅素血癥模型，但是靜脈置管方法對(duì)新生鼠操作難度相對(duì)較大?，F(xiàn)較多采用的是腹腔注射膽紅素建模方法［7］，具有操作簡(jiǎn)便，建模成功率高特點(diǎn)，但存在膽紅素腹腔吸收入血濃度不穩(wěn)定，血清膽紅素濃度偏低問(wèn)題，同靜脈注射方法存在共同的缺點(diǎn)是均不能良好的模擬新生兒高膽紅素血癥是紅細(xì)胞破壞增加的致病原因。Gunn大鼠多被用于開(kāi)展對(duì)遺傳性葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶缺陷的模型研究，其血液中膽紅素的濃度達(dá)不到核黃疸的程度，因此，有研究應(yīng)用磺胺類藥物通過(guò)置換結(jié)合膽紅素方法，加強(qiáng)了膽紅素對(duì)腦的損害作用［8］，或采用腹腔注射鹽酸苯肼的方法，誘發(fā)溶血來(lái)增加膽紅素水平濃度［9］，但是此類研究動(dòng)物模型成本較高，且基因缺陷是否造成免疫系統(tǒng)缺陷尚不明確。有報(bào)道采用新生大鼠小腦延髓池注射膽紅素溶液的方法制作膽紅素腦病的動(dòng)物模型，該方法雖受血腦屏障功能狀態(tài)的影響較小，可更直接地研究膽紅素的神經(jīng)毒性。但是對(duì)新生大鼠小腦延髓池注射本身即對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一種外傷性損害，操作難度較大，易誘發(fā)出血損傷，動(dòng)物建模成功率較低［10］。

目前采用鹽酸苯肼或乙酰苯肼建立的溶血?jiǎng)游锬Ｐ投嗍遣捎贸赡甏笫蠡蚱渌赡陝?dòng)物，腹腔注射濃度報(bào)道也多不一致，從40 mg/kg到75 mg/kg均有報(bào)道［3，11］，對(duì)7日齡溶血致高膽紅素血癥的研究國(guó)內(nèi)外較少。本研究采用25、50、75 mg/kg三種梯度的鹽酸苯肼腹腔注射7日齡大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn):三實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)溶血，與對(duì)照組相比較血、腦組織膽紅素水平和NSE均大于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)，而血紅蛋白含量均小于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05);其中，50 mg和75 mg劑量組的腦、血膽紅素水平均大于25 mg劑量組(P＜0.05)，50 mg/kg和75 mg/kg劑量腹腔注射組相比各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，提示50 mg/kg濃度已達(dá)溶血高峰，隨著鹽酸苯肼的濃度增高并未出現(xiàn)溶血增加;腹腔注射鹽酸苯肼誘發(fā)溶血，其機(jī)制是進(jìn)入腹腔后吸收入血，能迅速與Hb形成MHb并生成海因茲(Heinz)小體，海因茲小體沉積在細(xì)胞膜上，使其流動(dòng)性下降，滲透性增加，其并可裂解部分細(xì)胞膜功能，導(dǎo)致溶血發(fā)生，而鹽酸苯肼本身并無(wú)明顯神經(jīng)毒性，故能較好的模擬新生兒溶血致高膽紅素血癥病理生理過(guò)程，尤其研究對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷研究［12］。

模型鑒定中檢測(cè)的血清標(biāo)志物神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)和神經(jīng)細(xì)胞的分化和成熟有關(guān)，其特異性地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，腦組織缺氧缺血時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞可發(fā)生變性壞死，同時(shí)其血腦屏障通透性增加，NSE可釋放到血和腦脊液中，因此NSE可判斷神經(jīng)元損傷的程度和對(duì)預(yù)后的估計(jì)，且具有較高的特異性，可作為模型鑒定的指標(biāo)之一［13］。本研究中50 mg/kg和75 mg/kg劑量組的腦組織NSE水平均大于對(duì)照組及25mg劑量組(P＜0.05)，50mg和75mg劑量腹腔注射組相比NSE指標(biāo)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，隨著鹽酸苯肼的濃度增高并未出現(xiàn)腦組織NSE增加，提示NSE與溶血性黃疸致神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度呈正相關(guān)，與鹽酸苯肼水平無(wú)明顯相關(guān)性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選取7日齡大鼠腹腔內(nèi)注射鹽酸苯肼的方法能夠制作出模擬臨床病理生理過(guò)程的高膽紅素血癥動(dòng)物模型，其中50 mg/kg鹽酸苯肼是較為合適的建模濃度，從而建立理想的高膽紅素動(dòng)物模型，為開(kāi)展高膽紅素血癥致核黃疸及相關(guān)神經(jīng)損傷機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

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