宿文輝，賈曉宇，孟曉娜

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽 110122)

血睪屏障(blood－testis barrier，BTB)位于生精上皮近基底膜處相鄰支持細(xì)胞(Sertoli cell，SC)間，作為免疫屏障，BTB將生精細(xì)胞減數(shù)分裂及減數(shù)分裂后的發(fā)育過程同體循環(huán)相分隔，使這些過程在相對獨立的近腔小室中進(jìn)行［1，2］。BTB是哺乳動物體內(nèi)最為嚴(yán)密的血－組織屏障之一，這有賴于支持細(xì)胞間的緊密連接(tight junction，TJ)、TJ附近的基底特化粘著鏈接(basal ectoplasmic specialization，basal ES)以及位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與支持細(xì)胞膜間的肌動蛋白束(filamentous actin，F(xiàn)－actin)骨架［1，2］。在生精細(xì)胞穿越BTB進(jìn)入近腔小室進(jìn)一步發(fā)育的過程中，構(gòu)成BTB的細(xì)胞連接復(fù)合體及肌動蛋白骨架必須經(jīng)歷解聚及重建的動態(tài)過程［3］，體內(nèi)許多細(xì)胞因子和激素，如TNFα［4］、TGF－β3［5］、NO［6］、睪酮［2］等，就是通過調(diào)節(jié)該過程影響B(tài)TB的屏障功能。

Rab GTPase屬于Ras超家族，主要參與胞內(nèi)各種細(xì)胞期間的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運及內(nèi)吞、胞吐等過程［7］。在前期研究中，我們驗證了Rab13 GTPase在大鼠睪丸內(nèi)的表達(dá)分布隨生精上皮周期的變化而變化［8］，并發(fā)現(xiàn)Rab13可通過影響蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的活性調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞通透性［9］。本研究采用睪丸內(nèi) shRNA注射轉(zhuǎn)染沉默Rab13的表達(dá)，進(jìn)一步在大鼠體內(nèi)驗證Rab13－PKA途徑對BTB功能的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及動物

10只清潔級雄性 Sprague－Dawley大鼠，體重300 g左右，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供［SCXK(遼)2008－0005］。

BLOCK－iT U6 RNAi Entry載體購自 Invitrogen公司，無內(nèi)毒素超純質(zhì)粒純化試劑盒購自Qiagen公司，TransIT?EE Hydrodynamic Delivery Solution 為Mirus公司產(chǎn)品;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物試劑公司，ECL顯色試劑盒購自Thermo公司，PVDF 膜為 Millipore公司產(chǎn)品;［γ－32P］ATP 購自北京福瑞生物科技有限公司，PKA底物肯普肽購自Enzo Biochem公司，PKA抑制劑H89購自Selleck公司;兔抗Rab13抗體購自Abcam公司;兔抗occludin、兔抗 ZO－1、小鼠抗 β－catenin 抗體、CY3 標(biāo)記－驢抗兔IgG購自 Invitrogen;兔抗 N－cadherin、山羊抗β－actin抗體、牛抗兔、?？剐∈蟆⑴？股窖騃gG均購自Santa Cruz公司;羅丹明－鬼筆環(huán)肽購自Sigma公司，Prolong Gold Antifade封片劑購自Invitrogen;其他常規(guī)試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠睪丸內(nèi)shRNA轉(zhuǎn)染沉默Rab13表達(dá)

根據(jù)本實驗室已有Rab13 siRNA干擾序列［9］，采用BLOCK－iT RNAi Designer(Invitrogen)設(shè)計大鼠Rab13 shRNA(上游序列:5＇－GAUGUAAGUGCUGUUGAAGtt－3＇，下游序列:5＇－CUUCAACAGCACUUACAUCtt－3＇)及陰性對照 Ctrl shRNA(上游序列:5＇－AGGAGAUGUGAUAUUGGCUtt－3＇，下游序列:5＇－AGCCAAUAUCACAUCUCCUtt－3＇)， 均 克 隆 入BLOCK－iT U6 RNAi Entry載體，無內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒純化。睪丸內(nèi)注射前，用TransIT?EE Hydrodynamic Delivery Solution稀釋shRNA載體，消毒大鼠睪丸外皮膚，28號針頭量取稀釋的shRNA載體溶液于睪丸尾側(cè)端點處注射(125 μL/睪丸，含8 μg shRNA載體)，同一大鼠兩側(cè)睪丸分別注射Rab13 shRNA載體溶液(或含30 μmol/L PKA抑制劑H89的Rab13 shRNA載體溶液)及Ctrl shRNA載體溶液。24 h后(day 2)，對同一大鼠進(jìn)行等量shRNA載體注射。于不同時間(day 3、day 4、day 5)處死大鼠，所取睪丸均液氮冷凍后存儲于－80℃。

1.3 Western印跡

按睪丸尾側(cè)針孔切取shRNA載體溶液注射點周圍5 mm范圍內(nèi)組織，NP－40裂解液(50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，10% 甘油，2 mmol/L EGTA，1%Nonidet P－40，pH 8.0)冰上融化、剪碎組織塊，勻漿離心后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備睪丸組織蛋白樣品。各組蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，依次經(jīng)一抗(Rab13 －1∶500，occludin－1∶1000，ZO－1 －1∶1000，N－cadherin－1∶500，β－catenin－1∶1000，β－actin－1∶500)、二抗孵育(1∶3000)，ECL顯色，β－actin作為蛋白內(nèi)參照。

1.4 同位素?fù)饺敕y定PKA激酶活性

放射自顯影以肯普肽為底物測定PKA活性:上述睪丸組織裂解液稀釋至0.5 g/L，取7.5 μg蛋白裂解液加入50 μL PKA 反應(yīng)液(54 mmol/L β－甘油磷酸鹽，14.5 mmol/L對硝基苯磷酸鹽，24 mmol/L嗎啉代丙烷磺酸，14.5 mmol/L MgCl2，14.5 mmol/L乙撐雙四乙酸，0.12 mmol/L乙二胺四乙酸，1 mmol/L二硫蘇糖醇，75 μmol/L酪氨酸蛋白酶抑制劑，10 μmol/L ML－9，1 g/L 肯普肽，1 mg/L 蛋白酶抑制劑，pH 7.2)，混勻后加入 50 μCi/mL ［γ－32P］ATP，于37℃孵育30 min，加入等量樣品緩沖液終止反應(yīng)，SDS－PAGE分離肯普肽，晾干后放射自顯影，凝膠分析系統(tǒng)讀取肯普肽相應(yīng)自顯影帶，代表PKA活性。

同時通過同位素液閃計數(shù)驗證肯普肽的磷酸化程度:取5 μL上述裂解液加入25 μL PKA反應(yīng)液，混勻后加入 25 μL 20 μCi/mL ［γ－32P］ATP，于 30℃水浴7 min，各處理組取25 μL反應(yīng)液滴與Whatman p81濾紙，5%磷酸溶液終止反應(yīng)，充分清洗后使用Beckman液閃計數(shù)儀讀取濾紙γ－32P含量，以反映肯普肽的磷酸化程度。

1.5 睪丸組織免疫熒光染色檢測occludin在大鼠生精上皮的分布

液氮中取出day 5處死的大鼠睪丸，于－22℃冰凍切片(7 μm)，展開切片平鋪于載玻片上，4%多聚甲醛室溫固定10 min。0.1%Triton－100通透處理4 min后，用5%BSA封閉30 min，兔抗occludin抗體(1∶100，1%BSA 稀釋)于4℃孵育過夜，CY3標(biāo)記驢抗兔IgG(1∶150，1%BSA稀釋)室溫孵育1 h，Prolong Gold Antifade封片劑(含 DAPI)封片，O－lympus BX60熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。每次實驗(共3次)均在注射點周圍5 mm范圍內(nèi)隨機(jī)選取50個小管進(jìn)行觀察。

1.6 睪丸組織鬼筆環(huán)肽染色檢測F-actin在大鼠生精上皮的分布

如上述方法制作冰凍切片，經(jīng)固定、通透處理后，使用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(1∶200，1%BSA稀釋)室溫孵育1 h，Prolong Gold Antifade封片劑(含DAPI)封片，Olympus BX60熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大鼠睪丸內(nèi)Rab13沉默效果及其對BTB相關(guān)連接蛋白表達(dá)量的影響

為研究Rab13對大鼠BTB功能的影響，本研究采用睪丸內(nèi)shRNA轉(zhuǎn)染以實現(xiàn)在睪丸組織局部Rab13的沉默。通過將Rab13 shRNA載體及轉(zhuǎn)染試劑注射入大鼠睪丸實質(zhì)，選取注射點周圍組織進(jìn)行Western印跡分析，發(fā)現(xiàn)與對照RNAi組相比，Rab13 RNAi組Rab13的表達(dá)量顯著下降(約70%左右)，說明該方法可以干擾睪丸內(nèi)Rab13的表達(dá)(圖1)。同時，BTB 相關(guān)連接蛋白 occludin、ZO－1、N－cadherin及β－catenin的表達(dá)量在Rab13沉默前后并無改變，說明Rab13不能通過調(diào)節(jié)這些連接蛋白的表達(dá)影響B(tài)TB功能，亦表明本研究所用Rab13 shRNA無靶外效應(yīng)(圖1)。

注:＊＊P﹤0.01，與對照RNA干擾組比較。圖1 Western印跡檢測Rab13睪丸內(nèi)沉默后BTB主要連接蛋白表達(dá)水平Note.＊＊P﹤0.01，compared with the Ctrl RNAi group.Fig.1 Western blot analysis of the junction proteins of BTB after Rab13 RNAi silencing in the testis

2.2 Rab13睪丸內(nèi)沉默引起PKA活性升高

經(jīng)連續(xù)2 d在大鼠睪丸內(nèi)注射shRNA載體后，于第3、4、5天分別處死動物取睪丸組織，通過同位素?fù)饺敕ㄒ钥掀针臑榈孜餀z測PKA活性。放射自顯影(圖2，a)及液閃計數(shù)(圖2，b)結(jié)果均顯示Rab13沉默后睪丸組織內(nèi)PKA活性明顯升高，該結(jié)果與本實驗室體外Sertoli細(xì)胞中研究結(jié)果相一致［9］，說明Rab13可能通過調(diào)節(jié)PKA活性影響B(tài)TB功能。

注:放射自顯影(a)與液閃計數(shù)(b)測定PKA活性，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01，與對照RNA干擾組比較。圖2 同位素?fù)饺雽嶒灉y定Rab13沉默后睪丸組織PKA活性變化Note.Autoradiography(a)and scintillation counting(b)to detect PKA activity，*P﹤ 0.05，＊＊P﹤ 0.01，compared with the Ctrl RNAi group.Fig.2 Autoradiographic experiment to determine the PKA activity in the testis after Rab13 silencing

2.3 Rab13通過PKA調(diào)節(jié)緊密連接蛋白o(hù)ccludin在大鼠BTB的分布

為明確Rab13對BTB的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究采用免疫熒光染色檢測了BTB緊密連接蛋白o(hù)ccludin在Rab13沉默后的分布變化。根據(jù)occludin在正常大鼠的生精上皮周期依賴性的表達(dá)規(guī)律，即在VIII期生精上皮中表達(dá)量顯著下降［10］，我們觀察了Rab13沉默后不同期別生精上皮中occludin的表達(dá)分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 VII－VIII期生精上皮中，Rab13 RNAi組occludin在BTB處的分布明顯高于對照組(圖3，a vs.b)，而在其他期別的生精上皮中occludin的分布與對照組相比并無顯著改變(圖3，d vs.e)。我們同時觀察到，如在沉默Rab13的同時使用H89抑制PKA的活性，則occludin在任何期別生精上皮中的分布均無明顯變化(圖3，a vs.c，d vs.f)。這些結(jié)果表明，Rab13可能通過調(diào)節(jié)PKA的活性影響大鼠VIII期生精上皮BTB的動態(tài)變化，進(jìn)而影響前細(xì)線期精母細(xì)胞進(jìn)入近腔小室進(jìn)一步分化發(fā)育。

2.4 Rab13通過PKA調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架在大鼠BTB的分布

本實驗室前期研究表明Rab13可以通過PKA影響體外培養(yǎng) Sertoli細(xì)胞 F－actin的排布［9］，因此本研究中采用鬼筆環(huán)肽染色檢測了Rab13沉默后大鼠BTB中F－actin骨架的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rab13沉默后F－actin在BTB處的分布更為集中(圖4，a vs.b)，而PKA抑制劑H89可拮抗此效應(yīng)(圖4，a vs.c)。該結(jié)果與體外研究結(jié)果相一致，提示Rab13－PKA途徑可通過影響F－actin骨架調(diào)節(jié)大鼠BTB功能。

3 討論

生精小管是哺乳動物睪丸的基本功能單位，精子發(fā)生是生精小管上皮內(nèi)復(fù)雜的生物學(xué)過程，這一過程受到下丘腦－垂體－睪丸軸的嚴(yán)密調(diào)控［11］。在組織結(jié)構(gòu)上，血睪屏障(BTB)將生精上皮分為兩部分，即基底小室與近腔小室，這種特征使精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及隨后的各級生精細(xì)胞發(fā)育可以在相對獨立的近腔小室內(nèi)進(jìn)行，與體循環(huán)相分隔。BTB組成了一道天然的免疫屏障，可將大部分生精細(xì)胞的自身抗原與免疫系統(tǒng)隔離，避免了自身免疫反應(yīng)的發(fā)生［12］。然而，在整個生精上皮周期中，BTB并不是一直保持關(guān)閉狀態(tài)的，比如在大鼠VIII期生精上皮，需要重建BTB以使存在于基底小室內(nèi)的前細(xì)線期精母細(xì)胞跨越BTB進(jìn)入近腔小室內(nèi)繼續(xù)發(fā)育［13］。研究發(fā)現(xiàn)，此過程包括移行精母細(xì)胞后方“新”BTB的形成及其前方“舊”BTB的分解，且必須受到嚴(yán)密的調(diào)控以保證生殖細(xì)胞的穿越，同時避免免疫細(xì)胞或分子的通過［14］。因此，BTB的“開關(guān)”對血睪屏障功能的維持至關(guān)重要。

注:VII－VIII期(a－c)與 IV－V 期(d－f)生精上皮中 occludin 的分布。圖3 免疫熒光檢測Rab13沉默后occludin在大鼠BTB的分布(bar=50 μm)Note.Stage VII－VIII(a－c)and stage IV－V(d－f)seminiferous epithelium.Fig.3 Immunofluorescence analysis to detect the occludin distribution at BTB after Rab13 RNAi silencing in the rat testis

圖4 羅丹明－鬼筆環(huán)肽染色檢測Rab13沉默后F－actin在大鼠BTB的分布(bar=50 μm)Fig.4 Rhodamine－conjugated phalloidin staining to detect the F－actin distribution at BTB after Rab13 RNAi silencing in the rat testis

生精上皮內(nèi)各種細(xì)胞連接的有序分解與重建受到體內(nèi)多種因素的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞因子［15］(TNFα、TGF－β3)、睪酮［15］、肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白(Eps8［16］、Arp2/3［17］、drebrin E［18］、filamin A［19］)、蛋白酪氨酸激酶(c－Yes［20］、FAK［21］)等，這些因素主要通過間接或直接調(diào)節(jié)連接蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運或細(xì)胞連接處肌動蛋白絲的排布發(fā)揮作用。Rab GTPase是一族相對分子質(zhì)量為(20～30)×103的GTP結(jié)合蛋白，在研究上皮細(xì)胞緊密連接的過程中，人們發(fā)現(xiàn)了多種Rab GTPase在連接復(fù)合體中的定位，并發(fā)現(xiàn)有多種Rab GTPase參與調(diào)節(jié)緊密連接功能變化［7］。我們在前期研究中已驗證了Rab13在大鼠生精上皮中的表達(dá)［8］，并采用原代培養(yǎng)的大鼠 Sertoli細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)睪酮增強(qiáng)體外BTB屏障功能的過程伴有Rab13的表達(dá)下調(diào)和PKA活性的升高。在培養(yǎng)SC中采用siRNA沉默Rab13的表達(dá)后，可顯著增強(qiáng)體外BTB屏障功能，形態(tài)學(xué)結(jié)果表明Rab13對SC功能的影響可能是通過改變肌動蛋白骨架及緊密連接蛋白o(hù)ccludin在細(xì)胞連接處的分布［9］。

基于上述體外研究結(jié)果，本研究旨在在大鼠體內(nèi)驗證Rab13對BTB功能的影響。目前，已有多篇文獻(xiàn)報道shRNA睪丸內(nèi)注射轉(zhuǎn)染在BTB功能研究上的應(yīng)用，通過在大鼠睪丸一端將轉(zhuǎn)染試劑與shRNA載體注射入睪丸實質(zhì)，實現(xiàn)在睪丸局部沉默靶基因表達(dá)的目的［16，19，22］。我們根據(jù)已證明有效的Rab13 siRNA 序列［9］，構(gòu)建 shRNA 表達(dá)載體，睪丸內(nèi)轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)Rab13蛋白水平與對照組相比下降約70%。此外，與體外實驗結(jié)果一致，Rab13沉默后睪丸組織裂解液中PKA活性與對照組相比亦有明顯下降，提示Rab13可能通過影響PKA活性調(diào)節(jié)BTB功能。

相鄰支持細(xì)胞間的緊密連接(TJ)是賦予BTB屏障功能最重要的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，occludin、claudins和JAMs三種跨膜蛋白以及ZO－1、ZO－2等周邊蛋白在調(diào)節(jié)BTB的有序開放中發(fā)揮了重要作用，它們既作為TJ的結(jié)構(gòu)成分，又發(fā)揮著信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。其中，occludin在BTB的表達(dá)具有典型的生精上皮周期依賴性，即在大鼠VIII－XI期生精上皮中，occludin的表達(dá)顯著低于其他期別，這種表達(dá)模式有助于協(xié)調(diào)該階段BTB的重建及前細(xì)線期精母細(xì)胞通過Sertoli細(xì)胞間的緊密連接進(jìn)入近腔小室［10］。在對睪丸內(nèi)Rab13的表達(dá)進(jìn)行干擾后，我們進(jìn)一步采用免疫熒光檢測了occludin在生精上皮的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在VIII期生精上皮中occludin在BTB的分布顯著高于對照組，而在其他期別生精上皮occludin的分布并無明顯變化。在大鼠睪丸，VIII期生精上皮所占比例僅為7% ～10%［23］，因此我們在Western印跡中并未檢測到Rab13沉默后睪丸組織總體occludin水平有顯著變化。此外，Rab13沉默后生精上皮近基底部的F－actin分布也有明顯增多，該變化可能有助于“加固”Sertoli細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)。據(jù)此，我們推測Rab13－PKA途徑可以通過影響occludin和F－actin骨架參與大鼠BTB的周期性重建，進(jìn)而調(diào)節(jié)生精細(xì)胞在生精上皮內(nèi)的發(fā)育過程。

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