周舒雅，左琴，劉甦蘇，王辰飛，李保文，賀爭(zhēng)鳴，范昌發(fā)

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，北京 100050;2.北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司，北京 101111)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前已經(jīng)成為基因功能研究和藥物開(kāi)發(fā)篩選中不可或缺的工具。尤其，近年轉(zhuǎn)基因技術(shù)飛速發(fā)展［1－6］，其中通過(guò)同源重組(homologous recombination，HR)的基因打靶技術(shù)最為成熟，幾乎能夠滿(mǎn)足對(duì)任何基因不同時(shí)間、空間修飾表達(dá)的要求，應(yīng)用最為廣泛。C57BL/6背景的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)被認(rèn)為是用于同源重組的最佳選擇，其純背景使所獲得的基因打靶動(dòng)物省去了回交到C57BL/6的時(shí)間，從而也避免了由背景不純引起的不穩(wěn)定結(jié)果［7－9］。為了獲得C57BL/6 ES細(xì)胞的種系遺傳(germline transmission，GLT)，傳統(tǒng)認(rèn)為BALB/c品系作為囊胚供體效率最高［9－13］。然而，BALB/c胚胎獲得效率很低，并且對(duì)激素超數(shù)排卵不敏感［14］，所獲的胚胎均一性較差，相對(duì)于其他品系發(fā)育延遲［11，13］，因此，制約了利用 C57BL/6 ES 細(xì)胞制備打靶小鼠的效率。有研究嘗試通過(guò)體外成熟或者利用C3H×BALB/c的雜交胚胎等方法提高胚胎獲得的效率［11］，然而受BALB/c品系本身特性限制，很難有較大的提高。近年也有利用C57BL/6［15］及其Tyr基因突變的白化品系作為胚胎供體的研究，包括C57BL/6－Tyrc－Brd、C57BL/6N－TyrcWTSI 和 C57BL/6NTac－Atm1.1ArteTyrtm1Arte等［16－18］。然而，其中C57BL/6J和 C57BL/6－Tyrc－Brd 在F1代中不能通過(guò)毛色判斷是否成功種系遺傳。據(jù)近期報(bào)道，C57BL/6N－TyrcWTSI和C57BL/6NTac－Atm1.1ArteTyrtm1Arte具有通過(guò)毛色區(qū)分種系遺傳與否的能力，并且對(duì)激素超排敏感，但是目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)可用資源。本研究通過(guò)在多個(gè)不同基因修飾ES細(xì)胞的種系嵌合實(shí)驗(yàn)中，嘗試使用 ICR、B6(Cg)－Tyrc－2J等未見(jiàn)報(bào)道的小鼠品系作為囊胚供體，與BALB/c品系的種系嵌合效率相比較，從而為通過(guò)同源重組如何高效的制作基因打靶動(dòng)物提供有益的參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠233只，體重16～18 g，6周齡;SPF級(jí)ICR小鼠115只，體重20～22 g，6周齡;SPF 級(jí) B6(Cg)－Tyrc－2J小鼠 255 只，體重 16 ～ 18 g，6周齡;SPF級(jí)KM 小鼠30只，體重20～22 g，6周齡。本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心提供并飼養(yǎng)【SCXK(京)2009－0017】【SCXK(京)2014－0013】。無(wú)菌手術(shù)在中國(guó)食品藥品檢定研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(京)2011－0018】。

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 胚胎干細(xì)胞

C57BL/6J ES細(xì)胞系 B6－1－6由北京百奧賽圖生物技術(shù)有限公司提供。根據(jù)不同目的基因構(gòu)建的打靶質(zhì)粒經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后，線(xiàn)性化并用于ES細(xì)胞電轉(zhuǎn)染。經(jīng)G418篩選，以及基因組PCR檢測(cè)、Southern blot鑒定，以及核型檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性打靶ES細(xì)胞。經(jīng)鑒定的陽(yáng)性打靶ES細(xì)胞復(fù)蘇并傳代后，經(jīng)0.25%的胰酶消化成單細(xì)胞懸液置于冰盒，用于囊胚顯微注射。

1.3 試劑與儀器

M2(M7167－100ML，SIGMA)，KSOM(MR－121－D，Millipore)，0.7%戊巴比妥鈉溶液(Sigma)，PMSG(孕馬血清促性腺激素，寧波激素二廠(chǎng))，hCG(人絨毛膜促性腺激素，寧波激素二廠(chǎng))，石蠟油(M8410，Sigma)

顯微操作儀(1X71，Olympus)，體式顯微鏡(SMZ645，Nikon)，CO2培養(yǎng)箱(8000DH，Thermo)，持卵針(5175240006，Eppendorf)和注射針(930001040，Eppendorf)。

1.4 受體囊胚的采集

以 BALB/c 品系、ICR 系以及 B6(Cg)－Tyrc－2J品系小鼠為囊胚供體鼠。采用4～6周齡雌性小鼠，向小鼠腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)10 U，46～48 h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)10U。注射后與同品系雄鼠合籠交配，第2天早檢栓，計(jì)作0.5 d。

取用超數(shù)排卵或者自然排卵的3.5 d雌鼠，9∶00－10∶00，頸椎脫臼處死后取子宮，用 M2 培養(yǎng)液沖洗子宮回收囊胚，并移入覆蓋石蠟油的KSOM液滴中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

1.5 顯微注射［14］

13∶00－16∶00進(jìn)行囊胚顯微注射。在培養(yǎng)皿中央準(zhǔn)備M2注射液滴并覆蓋石蠟油，將ES細(xì)胞懸液及囊胚分別移入注射液滴，以斜口注射針吸取10～15個(gè)形態(tài)良好的ES細(xì)胞，沿滋養(yǎng)層細(xì)胞間隙注射到囊胚腔中，用KSOM溶液洗滌后移入KSOM培養(yǎng)液滴中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)恢復(fù)1～2 h后進(jìn)行胚胎移植。

1.6 胚胎移植及嵌合鼠獲得

選用KM小鼠做假孕母鼠，挑選發(fā)情前期和發(fā)情期雌鼠，1∶1與結(jié)扎雄鼠交配，次日檢栓，單籠飼養(yǎng)備用，見(jiàn)栓當(dāng)天為0.5 d，子宮移植用2.5 d假孕鼠。用0.7%戊巴比妥鈉溶液麻醉假孕鼠后，行背部手術(shù)將顯微注射恢復(fù)后的囊胚10～16個(gè)單側(cè)移植到假孕2.5 d的小鼠子宮，單籠飼養(yǎng)至妊娠第20天分娩。在小鼠出生7～10 d后可由毛色判定是否嵌合鼠，白色被毛來(lái)自于供體白化小鼠，黑色被毛來(lái)自于提供ES細(xì)胞的C57BL/6J小鼠。

1.7 嵌合鼠交配及打靶小鼠的獲得

嵌合鼠飼養(yǎng)至6～8周齡，嵌合鼠中雄鼠與野生型C57BL/6J雌鼠交配，如果ES細(xì)胞進(jìn)入嵌合鼠種系分化為生殖細(xì)胞，即可遺傳給子代小鼠，并表現(xiàn)為全黑的毛色。對(duì)黑色小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)，以確定陽(yáng)性打靶小鼠。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)中兩個(gè)數(shù)據(jù)間差異分析采用卡方檢驗(yàn)(χ2)，多組數(shù)據(jù)間差異分析采用SPSS 19.0軟件及Graphpad Prism 5.02軟件進(jìn)行單因素方差分析(One－Way－ANOVA)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同品系囊胚受體的獲得

我們選取了近交系 BALB/c，B6(Cg)－Tyrc－2J，以及封閉群ICR小鼠作為囊胚供體小鼠，交配后第3.5天囊胚用于胚胎干細(xì)胞的注射。其中由于據(jù)報(bào)道BALB/c品系對(duì)激素誘導(dǎo)超數(shù)排卵不敏感，因此同時(shí)比較了自然排卵所獲得的胚胎。如表1所示，ICR品系在囊胚采集方面效率最高，平均每只動(dòng)物可獲得可用囊胚6.03個(gè)，與其他品系和排卵方法相比呈現(xiàn)ICR激素超排＞BALB/c自然排卵＞B6(Cg)－Tyrc－2J激素超排 ＞ BALB/c 激素超排的趨勢(shì)。其中對(duì)于BALB/c品系，激素超排尚不如自然排卵效率高(0.82囊胚/只 vs 2.91囊胚/只)。而對(duì)于ICR來(lái)說(shuō)，不但相當(dāng)動(dòng)物量情況下胚胎總數(shù)多，而且可用于注射的囊胚占胚胎總數(shù)的比例也顯著高與其他品系，因此平均每只動(dòng)物的可用囊胚數(shù)明顯高于其他品系。并且，在第3.5天13:00觀(guān)察胚胎，如圖1所示，ICR囊胚相較于其他兩個(gè)品系的囊胚腔體擴(kuò)張更大，發(fā)育較均一;BALB/c胚胎有脫透明帶現(xiàn)象，且發(fā)育不均一。

表1 不同品系囊胚獲得效率比較Tab.1 Comparison of the derivation efficiency of blastocysts among the three mouse strains

注:a.BALB/c品系小鼠3.5 d囊胚;b.ICR品系小鼠3.5 d囊胚;c.B6(Cg)－Tyrc－2J品系小鼠3.5 d囊胚。標(biāo)尺=100 μm。圖 1 BALB/c、ICR 和 B6(Cg)－Tyrc－2J小鼠 3.5 d 囊胚的形態(tài)Note:a.Blastocysts from BALB/c mice at3.5 dpc(days post coitus);b.Blastocysts from ICR mice at 3.5 dpc;c.Blastocysts from B6(Cg)－Tyrc－2Jmice at 3.5 dpc.Bar=100 μm.Fig.1 Morphology of blastocysts from BALB/c mice，ICR mice and B6(Cg)－Tyrc－2Jmice at 3.5 dpc.

2.2 不同品系囊胚受體對(duì)嵌合體小鼠獲得效率的影響

為了比較囊胚遺傳背景對(duì)嵌合鼠獲得效率以及種系遺傳效率的影響，在三個(gè)不同基因修飾的ES細(xì)胞囊胚嵌合實(shí)驗(yàn)中，均采用了BALB/c、ICR和B6(Cg)－Tyrc－2J三種囊胚作為 ES細(xì)胞受體。由于三種ES細(xì)胞各自對(duì)不同的基因進(jìn)行了修飾，而所修飾的基因可能會(huì)影響嵌合的效率，因此表2～4分別比較了注射相同ES細(xì)胞的情況下，不同囊胚受體對(duì)嵌合鼠率以及種系遺傳率的影響。其中，B6(Cg)－Tyrc－2J作為囊胚受體時(shí)，僅ES細(xì)胞Ai3K獲得了嵌合鼠，但也未能種系遺傳，未獲得陽(yáng)性打靶動(dòng)物(表2－4)。而近交系BALB/c與封閉群ICR相比較，僅ES細(xì)胞Ai3K在利用 ICR獲得嵌合鼠的效率明顯高于BABL/c(表3)，在TLX3和SL的實(shí)驗(yàn)中，二者嵌合鼠率沒(méi)有顯著差異(表2，4)。進(jìn)而，我們通過(guò)單因素方差分析，統(tǒng)計(jì) BALB/c、ICR和 B6(Cg)－Tyrc－2J三種囊胚嵌合鼠獲得率均值的差異有顯著性，如圖2所示，BALB/c和ICR囊胚在獲得嵌合鼠的效率方面沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。

表2 不同囊胚作為T(mén)LX3－ES細(xì)胞受體所得嵌合鼠率及種系遺傳率Tab.2 Chimeras derivation and germline transmission efficiency of TLX3－ES cells with blastocysts of the three mouse strains as microinjection recipients

表3 不同囊胚作為Ai3K－ES細(xì)胞受體所得嵌合鼠率及種系遺傳率Tab.3 Chimeras derivation and germline transmission efficiency of Ai3K－ES cells with blastocysts of the three different mouse strains as microinjection recipients

表4 不同囊胚作為SL－ES細(xì)胞受體所得嵌合鼠率及種系遺傳率Tab.4 Chimeras derivation and germline transmission efficiency of SL－ES cells with blastocysts of the three different mouse strains as microinjection recipients

注:*代表二者在P＜0.05的水平差異有顯著性。圖 2 ICR、BALB/c 和 B6(Cg)－Tyrc－2J三種囊胚嵌合鼠獲得率顯著性分析Note.*indicates that difference is significant at P＜0.05 level.Fig.2 Significance analysis of blastocyst derivation efficiency among ICR，BALB/c and B6(Cg)－Tyrc－2Jmice

2.3 不同品系囊胚受體對(duì)種系遺傳效率的影響

ES細(xì)胞的種系遺傳是影響基因打靶小鼠獲得的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ES細(xì)胞注射到BALB/c和ICR囊胚中均可獲得黑白相間嵌合鼠，其中ES細(xì)胞可進(jìn)入種系分化為精子，進(jìn)而再與野生型C57BL/6雌鼠交配后，表現(xiàn)為黑毛色的小鼠(如圖3)。本研究比較了BALB/c和ICR囊胚作為ES細(xì)胞受體對(duì)種系遺傳效率的影響。在TLX3，Ai3K和SL三種ES細(xì)胞中，利用BALB/c囊胚的種系遺傳率均顯著高于ICR囊胚(P＜0.05)(如表2－4)。通過(guò)對(duì)BALB/c和ICR兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖4，可以更直觀(guān)地看到使用BALB/c囊胚和ICR囊胚在種系遺傳效率上的差異。

注:黑色小鼠為來(lái)源于C57BL/6 ES細(xì)胞種系遺傳的后代。圖3 嵌合鼠以及與C57BL/6雌鼠交配后代Note.The black coated pups are derived from germline transmission of C57BL/6 ES cells.Fig.3 Pups of male chimera mated with C57BL/6 female mice

圖4 ICR和BALB/c囊胚對(duì)C57BL/6 ES細(xì)胞種系遺傳效率的影響Fig.4 Effect of ICR and BALB/c blastocysts on germline transmission efficiency of C57BL/6 ES cells

3 討論

由于C57BL/6近交系小鼠遺傳背景信息豐富且清楚，因此在基因打靶小鼠模型的應(yīng)用中被生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究所廣泛接受［12］。雖然129品系的胚胎干細(xì)胞由于穩(wěn)定和易于種系嵌合等因素而更為常用［8］，但是不可避免地需要在獲得打靶動(dòng)物后回交到C57BL/6品系，因此十分耗時(shí)耗力。而直接通過(guò)C57BL/6胚胎干細(xì)胞同源重組制作基因打靶小鼠能夠極大地縮短周期。

對(duì)于 C57BL/6胚胎干細(xì)胞，傳統(tǒng)研究認(rèn)為BALB/c小鼠較適合作 ES細(xì)胞注射的囊胚供體［10］。然而B(niǎo)ALB/c胚胎有發(fā)育延遲，透明帶脆性強(qiáng)等特點(diǎn)，影響操作效率。因此有研究嘗試其他品系的囊胚，包括 C3H ×BALB/c雜交胚胎［19］，以及近期培育出的 C57BL/6N 白化突變品系［16－18］。我們嘗試用ICR品系和白化的 B6(Cg)－Tyrc－2J品系胚胎來(lái)替代BALB/c囊胚，三者均可通過(guò)F1代毛色判斷出是否成功種系遺傳。在與整體效率相關(guān)的三個(gè)環(huán)節(jié)——囊胚采集、囊胚注射獲得嵌合鼠，以及種系遺傳獲得打靶動(dòng)物中，我們分別比較了不同品系的囊胚對(duì)其影響。其中，與之前文獻(xiàn)報(bào)道相符［11］，利用BALB/c囊胚作受體在種系遺傳中效率確實(shí)明顯高于其他品系囊胚。然而，在囊胚獲得方面，由于BALB/c小鼠對(duì)激素超排不敏感，較難獲得大量的、發(fā)育均一的囊胚，因此ICR品系較之具有明顯優(yōu)勢(shì)。在嵌合鼠獲得效率上，ICR與BALB/c沒(méi)有顯著差異。同時(shí)，我們也嘗試比較了 B6(Cg)－Tyrc－2J品系，本研究中三種ES細(xì)胞在其中的嵌合效率較低，未能獲得種系遺傳?？傮w而言，除BALB/c小鼠外，ICR小鼠作為囊胚供體也能夠以較高的效率獲得C57BL/6胚胎干細(xì)胞的種系遺傳，因而可以作為C57BL/6胚胎干細(xì)胞囊胚注射中較好的選擇。

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