廖慧丹，龍玲玲，閆杰

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，長(zhǎng)沙 410013)

神經(jīng)科學(xué)是現(xiàn)代科學(xué)中進(jìn)展最為迅猛的研究領(lǐng)域之一，體外原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性及生長(zhǎng)發(fā)育特征與體內(nèi)非常相似，較少受到體內(nèi)循環(huán)、內(nèi)分泌等因素的影響，且便于直接觀察、檢測(cè)指標(biāo)，已成為神經(jīng)科學(xué)研究中必不可少的模型工具，細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量將直接影響研究工作的進(jìn)展［1－3］。

神經(jīng)元原代培養(yǎng)是指從活體獲得細(xì)胞或組織在體外條件下進(jìn)行的第一次培養(yǎng)，當(dāng)從胚胎腦組織中分離培養(yǎng)神經(jīng)元時(shí)，由于他們已在原位組織完成分裂時(shí)分化，所以培養(yǎng)的神經(jīng)元將不再會(huì)分裂、增殖，這使神經(jīng)元培養(yǎng)與其他種類體細(xì)胞培養(yǎng)相比有很大的不同［4］。目前，原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法有很多，本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)［5－9］，對(duì)機(jī)械吹打法、胰蛋白酶消化法以及木瓜蛋白酶法進(jìn)行比較研究，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的改良，旨在探討穩(wěn)定適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元培養(yǎng)方法及上述三種方法在皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)中各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為研究工作者根據(jù)各自條件選擇合適的培養(yǎng)方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及配制

多聚賴氨酸(L－polysine)，L－半胱氨酸(L－cysteine)，胰蛋白酶(tripsin)，木瓜蛋白酶 (papain)，聯(lián)咪二苯吲哚(DAPI):Sigma產(chǎn)品;D－Hank＇s平衡液，馬血清:Thermo產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)液，雙抗(青霉素，鏈霉素):Corning Cellgro產(chǎn)品;Neurobasal Medium，B27培養(yǎng)基添加劑:Gibco產(chǎn)品。胎牛血清:上海依科賽生物制品有限公司;兔抗大鼠NSE單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗兔Ig G(Abcam)。

L－polysine打底液:用滅菌 ddH2O配至工作濃度50 μg/mL。Tripsin 消化液:用 D－Hank＇s 溶液溶解配至工作濃度0.125%;木瓜蛋白酶消化液(papain):用 D－h(huán)ank＇s溶液配至工作濃度 200μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配;接種液配制(體積分?jǐn)?shù)):DMEM 83.5%，胎牛血清10%，馬血清5%，雙抗 1%，L－半胱氨酸1%;神經(jīng)元培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)):Neurobasal Medium 98%，B272%。所有配制液體均用0.22 μm篩網(wǎng)過濾。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

孕16～18日齡SPF級(jí)SD大鼠1只，雌性，350～400 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［SCXK(湘)2013－0004］。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)元培養(yǎng)

包被:L－polysine打底液包被六孔板，在37℃孵箱孵育30 min后吸棄液體，晾干過夜后用滅菌ddH2O洗板兩次，置于37℃孵箱孵干備用。取材:斷頸處死孕16～18 d SPF級(jí)SD大鼠，并在無(wú)菌條件下取出胎鼠;剝離胎鼠腦膜，取頂、顳葉大腦皮層的薄層腦組織置于DMEM溶液中，進(jìn)一步剝?nèi)ノ捶蛛x的腦膜，并將腦組織剪碎成約1 mm3大小，然后將腦組織與DMEM溶液的混合液分別移入3個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別標(biāo)記為機(jī)械吹打組、胰酶消化組、木瓜蛋白酶消化組。分離、培養(yǎng):機(jī)械吹打組:對(duì)培養(yǎng)皿中剪碎腦組織吹打30次，移入15 mL無(wú)菌離心管，離心5 min 1000 r/min。加入3 mL接種液后分層吹打，即:吹打10次，靜置2 min，取上清液，再吹打10次后，取上清液入離心管，再吹打10次后，取上清液入另一無(wú)菌離心管。臺(tái)盼蘭拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度(1.0×106個(gè)細(xì)胞/孔)，接種于經(jīng)包被的培養(yǎng)板中，置于37℃，5%CO2的孵箱內(nèi)孵育;胰酶消化組:在盛有大鼠腦組織的無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入2 mL胰酶消化液，混勻，37℃水浴箱消化15～20 min，5 min觀察、搖勻，然后加入等體積于胰酶消化液的胎牛血清終止消化，并轉(zhuǎn)移至15 mL無(wú)菌離心管中，吹打后離心5 min，1000 r/min，棄上清，加入5 mL接種液重懸細(xì)胞，按前述分層吹打步驟吹打細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種，孵育;木瓜蛋白酶消化組:在盛有大鼠腦組織的無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入3 mL木瓜蛋白酶消化液，混勻，37℃水浴箱消化20～30 min，每5 min搖勻一次，將消化后的組織轉(zhuǎn)移至15 mL無(wú)菌離心管中，吹打后離心5 min，1000 r/min，棄上清，加入5 mL接種液重懸細(xì)胞，按前述分層吹打步驟吹打細(xì)胞，計(jì)數(shù)，接種，孵育;各組孵育4 h后，全量換為神經(jīng)元培養(yǎng)液，72 h后全量換液，以后視細(xì)胞生長(zhǎng)情況，3～4 d半量換液，倒置相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 神經(jīng)元鑒定

免疫熒光鑒定NSE:4℃ PBS洗細(xì)胞3次，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞10 min，吸去多聚甲醛，PBS洗3次。用0.12%Triton X2100的PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理15 min，然后加入封閉液，室溫封閉1 h。換為相應(yīng)一抗(兔抗大鼠NSE單克隆抗體)4℃濕盒過夜，PBS清洗3次后加入FITC標(biāo)記的抗兔二抗，室溫避光孵育1 h。然后加入用DAPI室溫染細(xì)胞核5 min(避光)。PBS漂洗3次。90%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察NSE表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)取8個(gè)視野，攝像后計(jì)算每個(gè)視野中NSE表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占該視野總細(xì)胞數(shù)的比例，即為神經(jīng)元純度。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0分析軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元細(xì)胞在接種4 h后大部分貼壁，多數(shù)貼壁細(xì)胞成圓球狀，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)較小突起，呈蝌蚪樣(圖 1A、2A、3A)，6h后可見明顯的細(xì)胞突起;至第24 h神經(jīng)元細(xì)胞完全貼壁，光暈明顯，突起伸長(zhǎng)，可見軸突形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)(圖1B、2B、3B)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，神經(jīng)元細(xì)胞軸突形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)漸趨密集，3 d后神經(jīng)元胞體變大，細(xì)胞呈現(xiàn)多樣性，多為紡錘形、三角形及圓形。細(xì)胞突起增粗伸長(zhǎng)，可見雙極或多極神經(jīng)元，細(xì)胞突起交織成疏散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，視野中偶見不規(guī)則扁平的膠質(zhì)細(xì)胞(圖1C、2C、3C)。培養(yǎng)7 d后神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增大且突起延長(zhǎng)，形成復(fù)雜緊密的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(圖1D、2D、3D)，此時(shí)，神經(jīng)元成熟穩(wěn)定，可以作用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀糜谶M(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

注:1.機(jī)械吹打法，2.胰蛋白酶消化法，3.木瓜蛋白酶消化法。A、B、C、D分別為接種后4 h、24 h、3d、7d的皮質(zhì)神經(jīng)元。圖1 倒置相差顯微鏡觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的皮質(zhì)神經(jīng)元(×400)Note 1.Neurons dissociated by mechanical method;2.Neurons dissociated by trypsin digestion;3.Neurons dissociated by papain methods.A.Cultured for 4 hours，B.Cultured for 24 hours，C.Cultured for 3 days，D.Cultured for 7 days.Fig.1 Morphological changes of cultured neuronal cells were observed by light microscropy. ×400

2.2 神經(jīng)元鑒定

原代細(xì)胞中神經(jīng)元所占比例高，形態(tài)良好，核大而清晰(圖2:4A、5A、6A)。免疫熒光染色結(jié)果顯示NSE陽(yáng)性細(xì)胞在機(jī)械吹打組(圖2:4B)、胰酶消化組(圖2:5B)及木瓜蛋白酶消化組(圖2:6B)分別為96.28%，95.63%，97.34%，三組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)是神經(jīng)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一項(xiàng)重要技術(shù)。原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在Alzheimer’s病及帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及氯胺酮、甲基苯丙胺等神經(jīng)系統(tǒng)藥毒物研究中備受關(guān)注，已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究中重要的實(shí)驗(yàn)材料及模型工具［8］。本研究改良實(shí)驗(yàn)條件，運(yùn)用三種方法培養(yǎng)大鼠的體外培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元，光鏡下可見神經(jīng)元形態(tài)多為紡錘形、橢圓形及三角形，突起相互交織成網(wǎng)狀，具有神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征，經(jīng)免疫熒光染色，隨機(jī)選取視野計(jì)數(shù)后，神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞百分率均大于95%。提示三種方法均培養(yǎng)出高純度及發(fā)育成熟的神經(jīng)元。

注:4.機(jī)械吹打法培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元形態(tài)特征及鑒定;5.胰酶消化法培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元形態(tài)特征及鑒定;6.木瓜蛋白酶消化法培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元形態(tài)特征及鑒定。A:DAPI染核的圖像;B:NSE免疫熒光圖像。圖2 不同方法培養(yǎng)7d的皮質(zhì)神經(jīng)元免疫熒光染色(×400)Note.4.Neurons isolated by mechanical method，5.Neurons isolated by trypsin methods，6.Neurons isolated by papain digestion method.A:Nuclei of neurons are shown by DAPI staining;B:Stable networks are established，NSE staining，×400.Fig.2 Identification and morphological characteristics of neurons cultured for 7 days. ×400

神經(jīng)元原代培養(yǎng)主要有以下步驟:首先是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，將胎齡為16～18 d的SD大鼠胚胎作為實(shí)驗(yàn)材料，此胎齡的胎鼠皮層神經(jīng)元尚未發(fā)育成熟，抵抗損傷的能力較強(qiáng)，而膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量甚少，利用此階段的大鼠胚胎提取神經(jīng)元可以提高細(xì)胞的成活率并能較好地控制雜質(zhì)細(xì)胞的百分含量;再者取材過程中血管膜剝離是一個(gè)重要的步驟，若剝離不完全易導(dǎo)致神經(jīng)元分離困難，繼發(fā)吹打過度而造成神經(jīng)元大量死亡，且血管膜的細(xì)胞會(huì)混入原代培養(yǎng)中，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，胎鼠的血管膜較新生鼠易剝離，可以提高實(shí)驗(yàn)的成功率［10，11］。其次是取材，SD胎鼠從母鼠腹腔取出至腦皮層剪碎過程需時(shí)較長(zhǎng)，易造成神經(jīng)元損傷甚至死亡，多文獻(xiàn)中提出保持實(shí)驗(yàn)過程在冰上且冰浴的培養(yǎng)液中進(jìn)行，可以大大提高神經(jīng)元的存活率。此外，在解剖過程中，D－Hanks液的無(wú)糖環(huán)境對(duì)神經(jīng)元很不利，本實(shí)驗(yàn)用DMEM溶液浸泡解剖過程中的大腦，保持大腦的代謝活性，可提高神經(jīng)元的存活率。在最后的神經(jīng)元分離培養(yǎng)過程中，制作活性較高的單細(xì)胞懸液是培養(yǎng)過程中至關(guān)重要的步驟，制備神經(jīng)元單細(xì)胞懸液的方法主要有兩種:機(jī)械吹打法與酶消化法。其中吹打是一個(gè)關(guān)鍵的步驟，用槍頭緩慢吹打就可以達(dá)到好的效果，切忌過快，吹打過快可以導(dǎo)致大量神經(jīng)元死亡形成細(xì)胞碎片。分層吹打法取代過篩可以避免過篩可能導(dǎo)致的細(xì)胞丟失和損傷。而在消化分離過程中，使用酶消化時(shí)用35 mm或者60 mm培養(yǎng)皿盛放酶消化液，使消化液在培養(yǎng)皿里形成淺而廣闊的一層，均勻分布著組織塊，避免神經(jīng)元部分消化不足，部分消化過度導(dǎo)致的損傷甚至死亡。在培養(yǎng)過程中，有血清培養(yǎng)可以在種植初期促進(jìn)細(xì)胞快速恢復(fù)狀態(tài)，適應(yīng)環(huán)境及穩(wěn)定生長(zhǎng)，但血清刺激膠質(zhì)細(xì)胞和雜細(xì)胞分裂，影響神經(jīng)元的純度，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不均一，可能對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不良影響［6］，而使用 Neurobasal Medium及B27可以提高神經(jīng)元培養(yǎng)的純度，非神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞突起分化早、伸展快。本實(shí)驗(yàn)采用含血清種植液種植細(xì)胞，而用無(wú)血清飼養(yǎng)液維持細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，綜合雙方的優(yōu)勢(shì)，更有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展［6］。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用孕16～18 d SD大鼠胚胎作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)方面進(jìn)行改良如DMEM溶液浸泡解剖后的大腦、分層吹打法代替過篩離心等操作及培養(yǎng)皿盛放酶消化液進(jìn)行消化等，力使細(xì)胞培養(yǎng)過程中，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，降低污染，使神經(jīng)元的損傷達(dá)到最小化，提高神經(jīng)元培養(yǎng)的存活率。并且利用改良的實(shí)驗(yàn)條件，分別運(yùn)用三種不同方法均能成功培養(yǎng)出含雜質(zhì)量較少且純度高的皮層神經(jīng)元，其在不同生長(zhǎng)階段具有典型的形態(tài)學(xué)特征，每種培養(yǎng)方法都有其不同的特點(diǎn)。

機(jī)械分離法中用機(jī)械分離代替酶消化，其優(yōu)點(diǎn)在于:輕輕吹打?qū)?xì)胞的損傷小，細(xì)胞活性保持很好，并且操作流程簡(jiǎn)單;節(jié)約操作時(shí)間，減少污染。但是消化結(jié)果的穩(wěn)定程度與操作人員熟練程度相關(guān)，易形成難以消除的組織團(tuán)塊。胰蛋白酶消化是一種生化和化學(xué)性分離技術(shù)，而胰蛋白酶消化與pH、濃度、溫度和消化時(shí)間有關(guān)，濃度的大小、消化時(shí)間的長(zhǎng)短都會(huì)直接影響到細(xì)胞的產(chǎn)率和活性，此外，消化之前要掌握好皮質(zhì)組織塊剪碎的大小以及吸管吹打程度，以利于對(duì)胰蛋白酶消化時(shí)間的控制，而胰蛋白酶消化的徹底與否，直接關(guān)系到神經(jīng)元的生長(zhǎng)活性。因此，胰蛋白酶的濃度和作用時(shí)間需要嚴(yán)格控制，需要多次摸索實(shí)驗(yàn)條件。木瓜蛋白酶是消化過后神經(jīng)元存活率最高的酶［5，6］，木瓜蛋白酶的特點(diǎn)是不會(huì)過度消化，非常溫和。缺點(diǎn)是需要用無(wú)血清的培養(yǎng)液配來(lái)保證神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)代謝，而且一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，價(jià)格較前兩種方法昂貴，且木瓜蛋白酶消化法消化時(shí)間最長(zhǎng)，需要30 min左右，具體消化時(shí)間需要實(shí)驗(yàn)摸索確定。

隨著神經(jīng)元將被越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于包括細(xì)胞功能、神經(jīng)發(fā)育、退行性疾病、神經(jīng)藥毒理學(xué)等在內(nèi)的多領(lǐng)域、多層次的研究［12－17］，神經(jīng)元原代培養(yǎng)作為體外實(shí)驗(yàn)研究的工具愈顯重要。本實(shí)驗(yàn)改良并比較了三種原代神經(jīng)元培養(yǎng)的方法，為研究工作者根據(jù)各自條件選擇合適的培養(yǎng)方法提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)。

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