白亮，王蓉，羅肖，趙四海，劉恩岐

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部1.心血管研究中心動(dòng)脈粥樣硬化與脂代謝研究室;2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，西安 710061)

非酒精性脂肪肝(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。肝臟脂肪代謝長期紊亂，會(huì)逐漸發(fā)展為非酒精性肝炎、肝硬化，最終導(dǎo)致肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康。因而，探索調(diào)控肝臟脂肪代謝和系統(tǒng)能量平衡的分子機(jī)制對(duì)脂肪肝疾病的防治意義深遠(yuǎn)。

研究表明，肝臟脂肪代謝主要受過氧化物酶體增殖子激活受體(peroxisome proliferator－activated receptor，PPARs)調(diào)控［1，2］。PPARs 核受體超家族有三個(gè)成員:PPARα、PPARβ/δ 和 PPARγ［3］。PPARα在脂肪酸氧化代謝活躍的組織如肝、腎、心臟、小腸和骨骼肌中高表達(dá)，主要參與能量消耗［4］。文獻(xiàn)已報(bào)道，PPARα是脂肪酸的敏感器，通過調(diào)控線粒體、過氧化物酶體和微粒體氧化代謝系統(tǒng)影響肝臟脂質(zhì)代謝［5，6］。PPARα 失活，能量消耗減少，最終導(dǎo)致脂肪肝和肝炎［7，8］。

與PPARα作用相反，PPARγ主要參與能量儲(chǔ)存，是脂肪細(xì)胞分化、脂肪生成以及能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控子［3，9］。PPARγ在脂肪組織高表達(dá)，在肝臟組織表達(dá)較低，但其在肝臟脂肪生成中也發(fā)揮重要調(diào)控作用［10，11］。PPARγ的表達(dá)升高是脂肪肝的一個(gè)重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，在一些小鼠動(dòng)物模型中，如ob/ob和 PPARα－/－小鼠脂肪肝中，PPARγ 的表達(dá)顯著升高［12－14］。外源表達(dá)PPARγ導(dǎo)致小鼠生成脂肪肝，并誘導(dǎo)脂肪特異性基因和成脂相關(guān)基因的大量表達(dá)［11］。那么，激活PPARα是否會(huì)影響PPARγ對(duì)肝臟脂肪代謝的調(diào)控，目前尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠先給予PPARα激動(dòng)劑Wy－14，643，再給予 Ad/PPARγ 刺激，小鼠肝臟脂肪變性明顯減輕，表明激活 PPARα能夠有效緩解PPARγ誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變。本實(shí)驗(yàn)為研究肝臟脂肪代謝平衡提供了新的線索，為非酒精性脂肪肝的預(yù)防與治療提供了新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)野生型小鼠(C57BL/6J，wild type，WT)，4～5周齡，體重18～20 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(陜)2012－003】，實(shí)驗(yàn)在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物房進(jìn)行【SYXK(陜)2012－005】。12 h/12 h光照/黑暗交替，自由飲水。

實(shí)驗(yàn)分為4組，每組3～4只小鼠。第1組，即正常飲食(Teklad#7904;Harlan－Teklad，Indianapolis，IN)組;第2 組小鼠給予 0.125%Wy－14，643 的飲食8 d;第3組小鼠通過尾靜脈注射給予Ad/PPARγ(病毒濃度為1 ×1011vp，體積為300 μL)5 d;第4組小鼠預(yù)先給予0.125%Wy－14，643的飲食3 d，再尾靜脈注射給予Ad/PPARγ 5 d。所有動(dòng)物處理程序均符合美國NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法。

1.1.2 主要試劑、實(shí)驗(yàn)材料

Wy－14，643 購自美國 Sigma 公司;Ad/PPARγ病毒原液來自美國西北大學(xué)Feinberg醫(yī)學(xué)院Janardan K.Reddy教授實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘇木素－伊紅(H＆E)染色法

取一小塊肝臟組織，經(jīng)4%甲醛固定24～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。按以下步驟脫蠟染色:二甲苯(I)5 min，二甲苯(II)5 min，二甲苯(III)5 min;100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，蒸餾水沖洗3 min;蘇木素染色3 min，流水沖洗3 min;鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗3 min;0.2%氨水返藍(lán)10 s，自來水沖洗3 min;伊紅染色30 s，然后進(jìn)行脫水和透明，即80%乙醇3 min，95%乙醇 3 min，100%乙醇(I)3 min，100% 乙醇(II)3 min;二甲苯10 min，中性樹脂封片、照相。

1.2.2 油紅O染色法

從－80℃冰箱取出肝臟冰凍切片(5 μm)置于室溫5 min，4%的冰甲醛固定5 min，蒸餾水輕輕沖洗3次，放入100%丙二醇5 min(避免水進(jìn)入油紅O染液)，0.5%的油紅O染液60℃ 8 min。之后，用85%丙二醇洗滌5 min，蒸餾水輕輕沖洗3次。最后，用蘇木精復(fù)染5 s，自來水沖洗3 min，蒸餾水洗滌2次，甘油明膠封片、照相。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA)中的 One－way ANOVA進(jìn)行分析，用Tukey檢驗(yàn)法比較不同處理之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 大體形態(tài)學(xué)及肝臟/體重比變化

正常對(duì)照組小鼠肝臟形態(tài)正常，肝臟與體重比平均為5.5%(圖1A和E);當(dāng)給予PPARα激動(dòng)劑Wy－14，643處理8 d，小鼠肝臟出現(xiàn)肥大，肝臟與體重比平均為10.8%，表現(xiàn)明顯的過氧化物酶體增殖反應(yīng)(圖1B和E);野生型小鼠尾靜脈注射1×1011Ad/PPARγ 5 d，小鼠肝臟體積顯著增大，肝臟與體重比平均為14.6%，呈現(xiàn)典型脂肪肝(圖1C和E);預(yù)先給予小鼠PPARα激動(dòng)劑Wy－14，643處理 3 d，再給予Ad/PPARγ刺激5 d，小鼠肝臟增大更加顯著，肝臟與體重比高達(dá)17.3%，但脂肪肝表型減弱(圖1D和E)。

2.2 病理組織形態(tài)學(xué)分析

為了進(jìn)一步分析PPARα激活后對(duì)PPARγ刺激的小鼠脂肪肝的作用，我們進(jìn)行了H＆E和油紅O染色分析。H＆E染色和油紅O染色揭示，正常對(duì)照組小鼠肝臟組織形態(tài)正常，肝細(xì)胞中幾乎無脂肪積聚(圖2A和3A)，而Wy－14，643處理組小鼠肝細(xì)胞增殖明顯，肝細(xì)胞中也幾乎無脂肪積聚(圖2B和3B)。相反，Ad/PPARγ處理組小鼠肝細(xì)胞中聚集大量的脂肪(圖2C和3C)。與Ad/PPARγ處理組相比，用 PPARα 激動(dòng)劑 Wy－14，643預(yù)處理，再用Ad/PPARγ刺激，小鼠肝細(xì)胞中脂滴聚集明顯減少(圖2D和3D)。

3 討論

機(jī)體內(nèi)三大脂肪酸氧化系統(tǒng):線粒體β氧化、過氧化物酶體β氧化和微粒體ω氧化系統(tǒng)均受PPARα 調(diào)控［6，8］。研究表明，PPARα 通過上調(diào)脂肪酸氧化能力來控制脂肪酸攝入，進(jìn)而調(diào)控肝臟能量消耗［1，6，8］。而另一核受體成員 PPARγ 是脂肪生成的關(guān)鍵調(diào)控子，外源表達(dá)PPARγ能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)肝臟脂肪變性［10，11］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予PPARα激動(dòng)劑 Wy－14，643 預(yù)處理，再給予 Ad/PPARγ刺激，小鼠肝臟脂肪變性明顯減輕，提示激活PPARα能夠緩解PPARγ誘導(dǎo)的脂肪肝，為進(jìn)一步研究PPARα與PPARγ之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為臨床預(yù)防與治理脂肪肝疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

PPARα通過上調(diào)脂肪酸氧化代謝，進(jìn)而促進(jìn)能量消耗［1］。研究表明，給小鼠PPARα激動(dòng)劑—Wy－14，643能夠逆轉(zhuǎn)日糧誘導(dǎo)的肝臟纖維化和脂肪性肝炎［15］。同樣，給大鼠注射PPARα激動(dòng)劑—氯貝特類藥物，可抵抗蛋氨酸膽堿缺失日糧誘導(dǎo)的脂肪性肝炎，且使肝臟纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)［16］。相反，PPARα－/－小鼠在長期禁食狀態(tài)下呈現(xiàn)出嚴(yán)重的脂肪肝，主要是由于脂肪酸氧化代謝能力下降，不能有效氧化代謝進(jìn)入肝臟的脂肪酸［7］。而且，飼喂蛋氨酸膽堿缺失日糧的PPARα－/－小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的脂肪性肝炎［17］。與上述結(jié)果相一致，我們給野生型小鼠飼喂含有Wy－14，643的日糧，從肝臟大體形態(tài)以及組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，Wy－14，643有效地激活了PPARα，推測其有效啟動(dòng)了脂肪酸氧化系統(tǒng)。

PPARγ通過刺激成脂關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞脂質(zhì)的生成和儲(chǔ)存。研究發(fā)現(xiàn)，在ob/ob和PPARα－/－小鼠脂肪肝中，PPARγ的表達(dá)顯著升高［12－14］。外源表達(dá) PPARγ能促進(jìn) NIH3T3成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化并誘導(dǎo)生脂基因表達(dá)［11，18］。肝臟高表達(dá)PPARγ刺激小鼠形成脂肪肝，并誘導(dǎo)脂肪特異性基因和成脂相關(guān)基因的強(qiáng)烈表達(dá)［10］。相反，ob/ob和脂肪萎縮的AZIP小鼠背景下，肝臟特異性敲除 PPARγ 能顯著地緩解脂肪肝癥狀［19，20］。與上述結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)，給小鼠尾靜脈注射Ad/PPARγ，肝臟增大，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變，表明外源表達(dá)PPARγ促進(jìn)脂肪肝的形成，提示肝臟脂肪合成代謝增加，肝臟能量存儲(chǔ)增多。那么，PPARα與PPARγ的作用會(huì)不會(huì)相互抵消呢?

本研究中，預(yù)先給小鼠飼喂含有Wy－14，643的日糧，激活PPARα，啟動(dòng)其調(diào)控的脂肪酸氧化系統(tǒng)，再給小鼠尾靜脈注射Ad/PPARγ，外源表達(dá)PPARγ，刺激肝臟脂肪變性。肝臟大體形態(tài)和組織形態(tài)學(xué)表明激活PPARα可以有效減緩PPARγ誘導(dǎo)的脂肪肝。然而，有關(guān)脂肪形成、脂肪酸氧化系統(tǒng)相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)需要進(jìn)一步研究，以闡明激活PPARα緩解PPARγ誘導(dǎo)脂肪變的分子機(jī)制。

注:A.野生型小鼠肝臟;B.Wy－14，643處理組小鼠肝臟;C.Ad/PPARγ處理組小鼠肝臟;D.Wy－14，643+Ad/PPARγ處理組小鼠肝臟;E，肝臟重量與體重百分比，不同字母表示差異有顯著性(采用 Tukey方法進(jìn)行多重比較，其中，Control vs.Wy－14，643，Control vs.Ad/PPARγ，Control vs.Wy－14，643+Ad/PPARγ，Wy－14，643 vs.Ad/PPARγ，Wy－14，643 vs.Wy－14，643+Ad/PPARγ，P ＜ 0.01;Ad/PPARγ vs.Wy－14，643+Ad/PPARγ，P ＜0.05)。圖1 小鼠肝臟大體形態(tài)及重量變化Note.A.A wild－type mouse;B.A mouse treated with Wy－14，643;C.A mouse treated with Ad/PPARγ;D.A mouse liver treated with Wy－14，643+Ad/PPARγ;E.Liver to body weight ratio.The different letter shows significant difference(Tukey’s multiple comparison test，Control vs.Wy－14，643，Control vs.Ad/PPARγ，Control vs.Wy－14，643+Ad/PPARγ，Wy－14，643 vs.Ad/PPARγ，Wy－14，643 vs.Wy－14，643+Ad/PPARγ，P ＜0.01;Ad/PPARγ vs.Wy－14，643+Ad/PPARγ，P ＜0.05).Fig.1 Gross changes of the mouse livers.

注:A.野生型小鼠肝臟;B.Wy－14，643處理組小鼠肝臟;C.Ad/PPARγ 處理組小鼠肝臟;D.Wy－14，643+Ad/PPARγ 處理組小鼠肝臟。圖2 各組小鼠肝臟病理組織(H＆E染色，×20)Note.A.A wild－type mouse;B.A mouse treated with Wy－14，643;C.A mouse treated with Ad/PPARγ;D.A mouse liver treated with Wy－14，643+Ad/PPARγ.Fig.2 Histological appearance of the liver tissues.H＆E staining，×20

注:A.野生型小鼠肝臟;B.Wy－14，643處理組小鼠肝臟;C.Ad/PPARγ 處理組小鼠肝臟;D.Wy－14，643+Ad/PPARγ 處理組小鼠肝臟。圖3 各組小鼠肝臟病理組織(油紅O染色，×20)Note.A.A wild－type mouse;B.A mouse treated with Wy－14，643;C.A mouse treated with Ad/PPARγ;D.A mouse treated with Wy－14，643+Ad/PPARγ.Fig.3 Histological appearance of the mouse liver.Oil red O staining，×20

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