徐海和

miR-29b的作用靶點及其對Huh7細胞增殖及凋亡的干預作用

徐海和

目的 探討miR-29b（microRNA-29b）的作用靶點及其對肝腫瘤細胞系Huh7細胞增殖及凋亡的干預作用。方法 熒光定量PCR檢測正常肝細胞系LO2及肝癌細胞系Huh7的miR-29b和Mcl-1表達水平。通過生物信息學分析預測Mcl-1基因是否受microRNA調控。將miR-29b模擬物通過Lipofectamine 2000順時轉染Huh7細胞，檢測miR-29b對Mcl-1表達水平的影響。MTT法檢測miR-29b模擬物轉染對Huh7細胞增殖的影響。Annexin V/PI染色法檢測miR-29b對Huh7細胞凋亡的影響。結果 肝腫瘤細胞相比于正常肝細胞高表達Mcl-1（3.42±0.15比1.00±0.04，P＜0.05）低表達miR-29b（0.43±0.04比1.00±0.06，P＜0.05），在肝癌細胞中轉染miR-29b可使Mcl-1的表達水平下降（0.37±0.03比1.03±0.07，P＜0.05），轉染miR-29b可抑制Huh7細胞的增殖（0.85±0.11比1.68±0.17，P＜0.05）并誘導其發(fā)生凋亡［（28.4±2.10）%比（3.6±0.06）%，P＜0.05］。結論 MiR-29b下調Huh7細胞Mcl-1蛋白的表達并誘導其發(fā)生凋亡。

肝腫瘤；Huh7；Mcl-1；細胞增殖；細胞凋亡；miR-29b

MicroRNA（miRNA）是一類高度保守的小RNA，通過與其靶mRNA分子的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）不完全互補結合，抑制靶基因的蛋白表達[1-2]。miRNA被證實在細胞的各種生理活動中都發(fā)揮重要的作用，miRNA表達的失調是細胞癌變的重要特征[3-4]。肝癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，預后差，在全球死于癌癥及其并發(fā)癥的統(tǒng)計中，肝癌死亡率居所有惡性腫瘤的第3位[5]。然而，肝癌的發(fā)病機制至今仍不十分清楚，一些細胞保護性蛋白的高度表達可能是癌變細胞抵抗程序性死亡并發(fā)展為腫瘤細

胞的重要原因[6]。Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白成員，文獻[7-8]報道，Mcl-1高度表達是腫瘤細胞逃避程序性死亡的重要機制，并且也是腫瘤細胞對一些化療藥物耐藥的重要機制。文獻[9-10]報道，miR-29在多種腫瘤細胞中表達失調，miR-29具有良好的抑制腫瘤生長和轉移的生物效應。本研究發(fā)現(xiàn)miR-29b靶向于Mcl-1 mRNA的3'-UTR區(qū)，轉染miR-29b模擬物能抑制肝癌細胞的生長并促進其凋亡。

1 實驗材料

1.1 材 料 人肝癌細胞株Huh7和人正常肝細胞系LO2為本院臨床檢驗實驗室常規(guī)保存，細胞培養(yǎng)在RPIM-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃恒溫培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.2 試 劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購自于美國Gibco公司（產品號：11875-093）。miR-29b模擬物及對照RNA購自廣州銳博生物有限公司，序列如下：miR-29b模擬物：5′-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3′；對照RNA：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。噻唑藍（MTT，產品號：M2128）、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（產品號：APOAF）購于美國Sigma-Aldrich。Lipofectamine2000（產品號：11668030）、Trizol（產品號：15596-018）購于美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒（產品號：2641A）、SYBR Green（產品號：RR086A）購于日本TaKaRa。逆轉錄及定量PCR所需引物由上海生工有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 熒光實時定量PCR檢測Huh7細胞及LO2細胞miR-29b和Mcl-1表達水平 總RNA用TRIzol試劑提取，miR-29b采用特異性莖環(huán)引物法[11]進行miR-29b的逆轉錄，miR-29b逆轉錄引物序列為：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGA GAACACTGA-3′。Mcl-1直接用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉成cDNA，操作步驟照試劑盒說明書進行。逆轉錄產物用SYBR Green試劑按照說明書進行處理并在 Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System上進行 PCR擴增，Mcl-1基因以GAPDH mRNA作為內參，miR-29b以U6 small nuclear RNA（snRNA U6）作為內參，用2-ΔΔCt法分析Mcl-1和miR-29b的相對表達[12]。定量PCR引物序列見表1。

2.2 MTT法檢測細胞增殖 將Huh7細胞按5000個數(shù)目接種于96孔板中培養(yǎng)12h，按操作說明書將miR-29b（5pmol/孔）或對照RNA（5pmol/孔）用Lipofectamine 2000轉入Huh7細胞，培養(yǎng)24h，對照組不做任何處理培養(yǎng)24h，之后加5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞的增殖情況以OD570表示，OD570越高說明細胞增殖情況越良好。

2.3 細胞凋亡檢測 將Huh7細胞接種于6孔板中培養(yǎng)至細胞鋪滿板面70%左右面積，按操作說明書將miR-29b（100pmol/孔）或對照RNA（100pmol/孔）用Lipofectamine 2000轉入Huh7細胞，培養(yǎng)24h，對照組不做任何處理培養(yǎng)24h，收集細胞，按照試劑說明書將PI和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin-V陽性細胞越多，說明細胞凋亡程度越大。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗，實驗數(shù)據用（±s） 表示，所有實驗重復3次，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 肝癌細胞和正常肝細胞Mcl-1和miR-29b表達情況 熒光定量PCR檢測結果顯示，肝腫瘤細胞相比于正常肝細胞高表達Mcl-1，低表達miR-29b，兩者存在反比關系。見表2。

表2 肝癌細胞和正常肝細胞Mcl-1和miR-29b表達水平比較（±s）

表2 肝癌細胞和正常肝細胞Mcl-1和miR-29b表達水平比較（±s）

注：與LO2細胞比較，*P＜0.05

LO2細胞Huh7細胞33 1.00±0.04 3.42±0.15* 1.00±0.06 0.43±0.04*

3.2 miR-29b對Huh7細胞Mcl-1表達水平的影響

使用TargetScan工具（http：//www.targetscan.org）預測Mcl-1調控microRNA，結果發(fā)現(xiàn)Mcl-1 mRNA 3'-UTR存在miR-29b作用靶點（AUGGUGCUA，Mcl-1 3'-UTR的第1328到1336個堿基）。為了明確驗證miR-29b調控Mcl-1的表達水平，將miR-29b模擬物轉染Huh7細胞后檢測Mcl-1表達，結果發(fā)現(xiàn)轉染miR-29b模擬物相比于轉染對照RNA可顯著降低Mcl-1mRNA表達水平（P＜0.05），表明miR-29b確實能下調Mcl-1水平。見圖1、表3。

圖1 Mcl-1 3'-UTR存在miR-29b的結合位點

表3 miR-29b對Huh7細胞Mcl-1表達水平的影響（±s）

表3 miR-29b對Huh7細胞Mcl-1表達水平的影響（±s）

注：與對照RNA組比較，*P＜0.05

孔數(shù)miR-29b（pmol/孔）組別對照組對照RNA組miR-29b組333 00 100對照RNA（pmol/孔）0 100 0 Mcl-1 1.00±0.05 1.03±0.07 0.37±0.03*

3.3 MiR-29b對Huh7細胞增殖及細胞凋亡的影響

采用MTT法檢測Huh7細胞在miR-29b治療下的增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)miR-29b組相比于對照RNA組，細胞增殖顯著降低（P＜0.05）。流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn)，與對照RNA組比較，miR-29b組細胞凋亡水平明顯提高（P＜0.05）。結果提示miR-29b可能通過下調Mcl-1表達抑制肝癌細胞生長并誘導其發(fā)生凋亡。見表4。

表4 miR-29b對Huh7細胞增殖及細胞凋亡的影響（±s）

表4 miR-29b對Huh7細胞增殖及細胞凋亡的影響（±s）

注：與對照RNA組比較，*P＜0.05

對照組對照RNA組miR-29b組333 00 100 0 100 0 1.85±0.15 1.68±0.17 0.85±0.11* 2.6±0.04 3.6±0.06 28.4±2.10*

4 討論

Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中關鍵的抗凋亡蛋白，Mcl-1在人類各種腫瘤細胞系中均高度表達，有文獻表明，在肝細胞中Mcl-1的過表達是一個腫瘤特異性改變。將腫瘤細胞的Mcl-1基因沉默后會引起腫瘤細胞自發(fā)性凋亡，但不影響正常肝細胞[13-14]。Mcl-1對其他類型的腫瘤也起著十分重要的作用，通過下調細胞Mcl-1的水平可以有效抑制腫瘤細胞的生長增殖并降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性[15]。這些研究都提示，Mcl-1可以作為腫瘤治療的一個重要靶點。

MicroRNAs是一種生物效應很強的小分子核酸，在細胞中通過調節(jié)對應基因的表達參與細胞各項生理活動。研究表明microRNAs表達的改變往往會導致腫瘤的發(fā)生，一些特定的microRNAs還被用作腫瘤診斷及預后的評價指標[16]。本研究結果表明miR-29b的表達在Huh7細胞中相比于正常肝細胞系顯著下降，而Mcl-1基因在Huh7細胞中相比于正常肝細胞系表達顯著升高（P＜0.05），兩者存在反比關系。進一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-29b通過與Mcl-1 mRNA 3'-UTR的結合，下調Huh7細胞中Mcl-1的表達（P＜0.05）。此外，在Huh7細胞中轉染miR-29b可抑制Huh7（P＜0.05）細胞的生長，并且誘導其凋亡（P＜0.05）。本研究結果提示，miR-29b具有抗肝腫瘤的作用，miR-29b-Mcl-1途徑可能成為一個新的治療肝細胞肝癌的重要靶點。

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（收稿：2014-10-01 修回：2014-11-04）

Targets of m iR-29b and Its Effect on Proliferation and Apoptosis of Huh7 Cells

XU Haihe.Clinical Labo- ratory,Jiangshan People's Hosital,Jiangshan(324100),China

Objective To investigate the therapeutic targets of miR-29b and its effect on proliferation and apoptosis of hepatocarcinoma cell line Huh7.M ethods The expression of Mcl-1 and miR-29b in normal liver cell line LO2 and hepatocellular carcinoma cell line Huh7 was detected by qPCR.The putative binding sites of Mcl-1 gene was analyzed by using bioinformatic method.MiR-29b was transfected into Huh7 cells by Lipofectamine 2000, then the expression of Mcl-1 was detected.The cell growth was assessed by MTT after Huh7 cells transfected with miR-29b mimics.The apoptosis of cells was measured by Annexin V/PI staining.Results Compared with normal liver cells,Huh7 cells had higher expression of Mcl-1（3.42±0.15 vs 1.00±0.04,P＜0.05）and lower expression of miR-29b（0.43±0.04 vs 1.00±0.06,P＜0.05）.Transfection of miR-29b mimics suppressed Mcl-1 expression in Huh7 cells（0.37±0.03 vs 1.03±0.07,P＜0.05）and inhibited the proliferation of Huh7 cells（0.85±0.11 vs 1.68±0.17,P＜0.05）while inducing apoptosis in Huh7 cells[（28.4±2.1）%vs（3.6±0.06）%,P＜0.05].Conclusion MiR-29b downregulates the expression of Mcl-1 protein inducing apoaptosis in Huh7 cells.

Hepatocellular carcinoma;Huh7;Mcl-1;Cell proliferation;Apoptosis;miR-29b

浙江省江山市人民醫(yī)院檢驗科（江山 324100）