俞方紅黃曉燕

歐前胡素下調(diào)Mcl-1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡實(shí)驗(yàn)研究

俞方紅1黃曉燕2

目的 探討歐前胡素對人肝癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。方法 將人肝癌細(xì)胞系HepG2用5、10、20、40、80μM的歐前胡素處理24h或48h，以相同培養(yǎng)條件不加歐前胡素的HepG2細(xì)胞為對照組，MTT法檢測歐前胡素治療后HepG2細(xì)胞的增殖抑制情況；HepG2細(xì)胞用10、20、40μM的歐前胡素處理24h，通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測歐前胡素對HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）的表達(dá)；在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1-Mcl-1真核表達(dá)載體后再用歐前胡素治療，檢測歐前胡素對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果 10、20、40、80μM歐前胡素組增殖抑制率分別為24h：（7.2±1.7）%、（14.5±2.6）%、（37.4±3.7）%、（56.3± 4.3）%；48h：（14.5±2.1）%、（23.6±3.0）%、（52.3±4.8）%、（78.3±5.9）%，與對照組（0）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；10、20、40μM歐前胡素組凋亡誘導(dǎo)率分別為（3.9±0.8）%、（12.4±1.8）%、（26.9± 2.5）%，與對照組（0.5±0.2）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。歐前胡素治療后，HepG2細(xì)胞的Mcl-1表達(dá)水平顯著下降，用pcDNA-3.1-Mcl-1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，歐前胡素對HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率較空pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染組顯著下降［（6.8±1.2）%比（25.7±2.3）%，P＜0.05］。結(jié)論 歐前胡素具有體外抗肝腫瘤的生物活性，其抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制可能是通過下調(diào)Mcl-1蛋白表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

人肝癌細(xì)胞HepG2；歐前胡素；Mcl-1；凋亡

肝癌是我國死亡率最高的癌癥之一[1]，手術(shù)和肝移植是早期肝癌最常用的治療手段，且治愈率較高。但是超過80%的肝癌患者在被發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于中晚期，腫瘤組織往往難以切除并伴隨轉(zhuǎn)移灶，預(yù)后很差，只能采取化療手段治療[2]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是化療藥物的重要機(jī)制，然而長期化療常常造成腫瘤細(xì)胞通過抵抗凋亡而對化療藥物耐藥[3]，因此尋找新的治療方法十分重要。歐前胡素是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質(zhì)，據(jù)報(bào)道有十分良好的抗腫瘤效應(yīng)[4]。歐前胡素對肝腫瘤的抑制效應(yīng)及機(jī)制目前仍不清楚，筆者觀察歐前胡素對人肝癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)歐前胡素可顯著抑制肝腫瘤細(xì)胞的生長，其機(jī)制可能在于通過下調(diào)Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）的表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系HepG2為本院臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室保存，購于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 試 劑 DMEM培養(yǎng)基（批號：11995-065），購于美國Gibco公司。歐前胡素（批號：I6659）、噻唑藍(lán)（MTT，批號：M2128），均購于Sigma-Aldrich。PI/AnnexinⅤ凋亡試劑盒（批號：88-8005-74），購于美國ebioscience。細(xì)胞蛋白裂解液（批號：#9803），切割型PARP抗體（cleaved PARP，批號：#9541，僅識別切割型PARP抗體，不能識別全長PARP），Mcl-1抗體（批號：#5453）及β-actin抗體（批號：#4967），均購于美國cell signaling公司。PVDF膜購于美國Millipore公司（批號：IPVH00010）。pcDNA3.1（批號：V790-20），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（批號：11668030），Trizol（批號：15596-018），均購于Invitrogen公司。ECL顯色試劑盒（批號：W1001），購于promega公司。

1.3 MTT試驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞按1000個/孔接種于96孔板，加入200μL DMEM培養(yǎng)，設(shè)置3個復(fù)孔，分別加入5、10、20、40、80μM的歐前胡素培養(yǎng)24、48h，對照組為不加歐前胡素同樣條件培養(yǎng)24、48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞增殖抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（對照組OD值-歐前胡素組OD值）/對照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) HepG2細(xì)胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法檢測。在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入10、20、40μM的歐前胡素培養(yǎng)24h，對照組為不加歐前胡素同樣條件培養(yǎng)24h，將5μL Annexin V/PI檢測液加入細(xì)胞中37℃孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡率用Annexin V陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示[5]。

1.5 Western blot試驗(yàn) 在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入10、20、40μM的歐前胡素培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并裂解，裂解后的蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜在Mcl-1、cleaved PARP或β-actin一抗稀釋液中孵育過夜，之后在帶辣根過氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光，以Mcl-1或cleaved PARP顯色條帶與β-actin顯色條帶的灰度比值表示蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞用Trizol試劑裂解后提取mRNA，用PCR法擴(kuò)增Mcl-1基因的cDNA全長序列（Gene ID：NM_001197320.1）。引物如下：正向引物：5’-GAGAAGCTTGCCACTTCTCACTT CCGCT-3’，反向引物：5’-TGGAATTCATAATCC TCTTGCCACTTGC-3’（下劃線堿基分別為HindⅢ，EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過酶切位點(diǎn)與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-Mcl-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒。將HepG2細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞密度生長到鋪滿板面約80%時(shí)按Lipofectamine 2000操作說明書在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2μg pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)?；?qū)φ湛誴cDNA3.1質(zhì)粒培養(yǎng)24h，之后加40μM的歐前胡素再培養(yǎng)24h，檢測細(xì)胞增殖抑制率，凋亡水平和cleaved PARP表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，P值計(jì)算采用非配對雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 歐前胡素對人肝癌細(xì)胞系HepG2生長的抑制作用 歐前胡素呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制HepG2細(xì)胞的生長，見表1。

2.2 歐前胡素下調(diào)HepG2細(xì)胞Mcl-1表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 歐前胡素呈劑量依賴性誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，見表2。

2.3 外源性Mcl-1表達(dá)廢除歐前胡素對HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)?？娠@著升高M(jìn)cl-1的表達(dá)（P＜0.05），減弱歐前胡素對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（P＜0.05）。見表3～4。

表1 歐前胡素對HepG2細(xì)胞的抑制作用（±s）

表1 歐前胡素對HepG2細(xì)胞的抑制作用（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與5μM歐前胡素組比較，△P＜0.05；與10μM歐前胡素組比較，§P＜0.05；與20μM歐前胡素組比較，○P＜0.05；與40μM歐前胡素組比較，□P＜0.05；與同濃度歐前胡素處理24h比較，#P＜0.05

對照組5μM歐前胡素組10μM歐前胡素組20μM歐前胡素組40μM歐前胡素組80μM歐前胡素組333333 051 0 20 40 80 0 2.3±0.55 7.2±1.7* 14.5±2.6*§37.4±3.7*○56.3±4.3*□0 4.8±0.59 14.5±2.1*#△23.6±3.0*#§52.3±4.8*#○78.3±5.9*#□

表2 歐前胡素下調(diào)HepG2細(xì)胞Mcl-1表達(dá)誘導(dǎo)凋亡（±s）

表2 歐前胡素下調(diào)HepG2細(xì)胞Mcl-1表達(dá)誘導(dǎo)凋亡（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與10μM歐前胡素組比較，△P＜0.05；與20μM歐前胡素組比較，#P＜0.05

組別對照組10μM歐前胡素組20μM歐前胡素組40μM歐前胡素組3333 0 10 20 40 0.5±0.2 3.9±0.8* 12.4±1.8*△26.9±2.5*#0 0.04±0.01 0.11±0.03*△0.29±0.06*#1.12±0.16 0.92±0.12* 0.58±0.07*△0.29±0.05*#孔數(shù)歐前胡素濃度（μM）凋亡率（%）cleaved PARP/-actin Mcl-1/ -actin

表3 pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒對歐前胡素抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

表3 pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒對歐前胡素抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與空pcDNA3.1組比較，#P＜0.05

組別對照組空pcDNA3.1組pcDNA3.1-Mcl-1組孔數(shù)pcDNA3.1-Mcl-1質(zhì)粒（μg） 空pcDNA3.1質(zhì)粒（μg）333 002 220歐前胡素濃度（μM）0 40 40 Mcl-1/-actin 1.08±0.14 0.32±0.06* 1.34±0.21*#24h抑制率（%）0 36.5±4.1* 10.5±2.7*#

表4 pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒對歐前胡素抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

表4 pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒對歐前胡素抗腫瘤效應(yīng)的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與空pcDNA3.1組比較，#P＜0.05

組別對照組空pcDNA3.1組pcDNA3.1-Mcl-1組孔數(shù)pcDNA3.1-Mcl-1質(zhì)粒（μg） 空pcDNA3.1質(zhì)粒（μg）333 002 220歐前胡素濃度（μM）0 40 40凋亡率（%）0.6±0.2 25.7±2.3* 6.8±1.2*#cleaved PARP/-actin 0 0.31±0.06* 0.07±0.02*#

3 討論

腫瘤細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制是對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)的抵抗，因此研究腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡的分子機(jī)制并開發(fā)新的治療藥物是中晚期肝癌治療的重要方法。Mcl-1最早在人髓白血病細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)，其序列和功能與Bcl-2相似，但Mcl-1的半衰期很短且受多種內(nèi)源性分子的調(diào)控[6]。Mcl-1定位于線粒體外膜，通過與一些促凋亡蛋白如Bim、Bak和NOXA等形成異二聚體使之失活，從而阻斷細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，抑制細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[7-8]。近些年研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，Mcl-1的表達(dá)水平和腫瘤細(xì)胞存活與化療藥物耐藥密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞Mcl-1的高表達(dá)顯著降低了它們對化療藥物所致凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的敏感性。歐前胡素是一種香豆素類化合物，提取于白芷根部，研究發(fā)現(xiàn)其有很強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，能誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系HL-60的凋亡[11]，與順鉑合用顯著殺傷人宮頸癌細(xì)胞等[12]。然而歐前胡素誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制至今仍不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)歐前胡素具有顯著的體外抗肝腫瘤的生物效應(yīng)，其機(jī)制為誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。歐前胡素還可顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)，當(dāng)轉(zhuǎn)染外源性Mcl-1表達(dá)載體后，Mcl-1水平顯著上升并且廢除了歐前胡素的抗腫瘤效應(yīng)，由此證明抑制Mcl-1的蛋白表達(dá)可能是歐前胡素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。歐前胡素呈劑量依賴性誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。PARP（poly ADP-ribose polymerase）是DNA修復(fù)酶，是細(xì)胞凋亡核心成員天冬氨酸酶（caspase）的切割底物，因此切割型PARP（cleaved PARP）是細(xì)胞凋亡的標(biāo)記蛋白[13]。Mcl-1是腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的抗凋亡蛋白，其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡和耐藥有關(guān)[14]。歐前胡素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能和下調(diào)Mcl-1蛋白水平有關(guān)，本組結(jié)果顯示，歐前胡素有良好的抗肝腫瘤生物活性，為肝癌細(xì)胞的促凋亡治療提供了新的途徑和理論依據(jù)。

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（收稿：2014-11-08 修回：2014-12-14）

Imperatorin Down-regulates the Expression of M cl-1 Inducing the Apoptosis in Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

YU Fanghong1,HUANG Xiaoyan2.1 Clinical Laboratory,Ningbo Municipal Women and Children's Hospital,Ningbo(315031),China;2 Central Laboratory,Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital, Ningbo(315040),China

Objective To investigate the inhibitory effect of imperatorin on human hepatocellular carcinoma cells and the underlying mechanism.M ethods HepG2 cells were treated with 0（control group）,5,10,20,40,and 80 μM imperatorin for 24 or 48 h,then MTT assay was used to detect the proliferation of HepG2 cells.The apoptosis of HepG2 cells and the expression of Mcl-1 was assessed by flow cytometry and western blot in HepG2 cells treated with 10,20,40μM imperatorin for 24 h.The vector of pcDNA-3.1-Mcl-1 was transfected in HepG2 cells before treated with imperatorin,then the proliferation and apoptosis of cells were detected.Results The inhibition rate of proliferation of HepG2 cells treated with 10,20,40,and 80μM imperatorin was as follows：（7.2±1.7）%,（14.5±2.6）%,（37.4±3.7）%,and（56.3±4.3）%for 24h;（14.5±2.1）%,（23.6±3.0）%,（52.3±4.8）%,and（78.3± 5.9）%for 48h,all with significant difference compared with control group（P＜0.05）.The apoptosis rate of 10,20, and 40μM group was（3.9±0.8）%,（12.4±1.8）%,and（26.9±2.5）%,respective,all with significant differences compared with that of control group[（0.5±0.2）%,P＜0.05].Imperatorin treatment significantly decreased the expression of Mcl-1.Transfection of pcDNA-3.1-Mcl-1 inhibited the anti-tumor effect of imperatorin [（6.8±1.2）%vs（25.7± 2.3）%,P＜0.05].Conclusion Imperatorin exerts anti-tumor bio-activity.It may induce apoptosis of HepG2 cells via down-regulating the expression of Mcl-1.

Human hepatocellular carcinoma cell HepG2;Imperatorin;Mcl-1;Apoptosis

1浙江省寧波市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科（寧波 315031）；2浙江省寧波市李惠利醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（寧波 315040）

俞方紅，Tel：13957819709