李 靖，路莎莎

張掖市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅張掖734000

星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)選白芷中歐前胡素和異歐前胡素的醇提工藝

李 靖，路莎莎

張掖市中醫(yī)醫(yī)院，甘肅張掖734000

目的：利用效應(yīng)面法優(yōu)選白芷的醇提取工藝參數(shù)。方法：采用HPLC方法，Waters公司的Sunf ire C18色譜柱（150 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30），等度洗脫；流速0.9mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃；分析時(shí)間為20分鐘；進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：白芷中歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度83.17%，提取時(shí)間9.15小時(shí)，甲醇用量為147.32mL；異歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度91.83%，提取時(shí)間9.15小時(shí)，甲醇用量為112.68mL。結(jié)論：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)與效應(yīng)面法相結(jié)合的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)工藝優(yōu)化更方便、更準(zhǔn)確。

白芷；歐前胡素；異歐前胡素；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；效應(yīng)面法

白芷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.)Benth.et Hook.f或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，因初生根桿為芷，色白，故名白芷，其性溫，氣芳香，味辛，微苦，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿的作用，臨床廣泛應(yīng)用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶、瘡瘍腫痛等病癥，并有較好的療效［1-2］。白芷全株含揮發(fā)油，由根揮發(fā)油中檢出29種化合物，其質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分為歐前胡素和異歐前胡素［3］。星點(diǎn)設(shè)計(jì)是在二水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上星點(diǎn)(star point)及中心點(diǎn)(cent ral point)而成的實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，適宜進(jìn)行非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，具有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，試驗(yàn)次數(shù)少，精密度高的特點(diǎn)［4-6］，筆者使用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法三維效應(yīng)面法對(duì)白芷中歐前胡素和異歐前胡素的提取工藝進(jìn)行篩選，優(yōu)選出最佳的方法，為白芷中有效成分提取分離工藝研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 藥材與試劑、儀器

1.1 藥材 經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院楊福德教授鑒定為杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hof fm.) Benth.et Hook.f.var.form osana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，均為正品藥材。

1.2 試劑 歐前胡素(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司提供，純度大于99.9%，批號(hào)：DQ201010)，異歐前胡素(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司提供，純度大于99.9%，批號(hào)：YD201012)，甲醇(天津市紅巖化學(xué)試劑廠提供)，乙腈色譜純(成都金山化學(xué)試劑有限公司提供)，哇哈哈純凈水等。

1.3 儀器 高效液相色譜儀(Waters600、四元泵、在線脫氣系統(tǒng)、手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、Waters2487型紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、Empower色譜工作站)；超聲波清洗器(KQ2200DB，40 kHz，80W，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司提供)；BS201型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司提供)；回流裝置。

1.4 色譜條件色譜柱：Waters公司的Sunf ire C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(70∶30)，等度洗脫；流速0.9mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30℃；分析時(shí)間為20分鐘；進(jìn)樣量10μL；歐前胡素的保留時(shí)間為(9.489±0.007)分鐘；異歐前胡素的保留時(shí)間(14.767±0.012)分鐘；各樣品色譜圖中，分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)大于3 000；拖尾因子在0.95～1.05之間。

1.5 溶液制備

1.5.1 對(duì)照品溶液 精密稱取異歐前胡素對(duì)照品1.80mg，加甲醇50mL制成濃度為0.036mg/mL的對(duì)照品溶液；精密稱取歐前胡素對(duì)照品1.75mg，加甲醇50mL制成濃度為0.035mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.5.2 供試品溶液 參照《中國(guó)藥典》白芷含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法［7］。稱取5 g份的白芷樣品20份按照據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)方案，甲醇濃度、提取時(shí)間、加入甲醇量3個(gè)自變量的水平極值分別為：X1(甲醇濃度)：80%～95%；X2(提取時(shí)間)6～10小時(shí)；X3(甲醇用量)100～160mL配制待用。

2 方法學(xué)考察

2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品異歐前胡素溶液0.5、1.0、2.5、3.0、4.0、5.0mL置于10mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20μL，以對(duì)照品濃度對(duì)峰面積積分分值線性回歸得異歐前胡素的回歸方程為：Y=6.6×107X-1.761 9×104，相關(guān)系數(shù)r=0.999 2。精密吸取對(duì)照品歐前胡素溶液0.4、0.6、2.0、3.0、5.0mL置于5mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20μL，以對(duì)照品濃度對(duì)峰面積積分分值線性回歸得歐前胡素的回歸方程為：Y=6.2×107X-1.07×104相關(guān)系數(shù)r=0. 999 1。結(jié)果表明異歐前胡素和歐前胡素的含量分別在0.001 8～0.018 mg/mL和0.002 8～0.035mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，得到異歐前胡素和歐前胡素峰面積，計(jì)算異歐前胡素峰面積的RSD為0.37% (n=5)，歐前胡素的峰面積的RSD為0.30%(n=5)，表明本方法精密度良好。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取白芷，按供試品制備方法制備5份樣品溶液，得到異歐前胡素和歐前胡素峰面積，計(jì)算歐前胡素峰面積的RSD為1.46% (n=5)，異歐前胡素峰面積RSD為1.51%(n=5)。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取白芷的供試品溶液，分別在0、2、6、8、12小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算歐前胡素峰面積的RSD為0.99%(n=5)，異歐前胡素的峰面積的RSD為2.39%(n=5)，結(jié)果表明樣品在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量的對(duì)照品，制得樣品溶液后，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果歐前胡素的回收率為97.6%，RSD為1.7%，異歐前胡素的回收率為98.8%，RSD為1.5%。

3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)選白芷提取工藝

3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇對(duì)甲醇提工藝影響較大的因素，即醇提濃度、提取時(shí)間、甲醇用量3個(gè)主要因素。水平安排遵循任意兩個(gè)物理量之間的差值與對(duì)應(yīng)代碼之間差值成等比的原則。采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)方法進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，用效應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。如以X2為例，代碼1所對(duì)應(yīng)的物理量N的求算：(N-6)/ (10-6)=[1-(-1.732)]/[1.732-(-1.732)]，N=[1-(-1.732)]/[1.732-(-1.732)]×(24-6)+6=9.2。3個(gè)因素的取值見(jiàn)下表，以歐前胡素和異歐前胡素提取率、相對(duì)總峰面積做為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)優(yōu)選醇提工藝，因素水平見(jiàn)表1。

表1 甲醇提工藝3個(gè)考察因素的代碼水平及對(duì)應(yīng)物理量

3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 取白芷藥材50 g，按照表1中實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行提取，HPLC測(cè)定溶液中歐前胡素和異歐前胡素含量，并計(jì)算其提取率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及供試品重疊色譜圖見(jiàn)圖1、表2。

圖1 重疊色譜圖

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

4 數(shù)據(jù)處理

4.1 模型擬合 以樣品白芷中歐前胡素和異歐前胡素提取率為因變量，對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二次多項(xiàng)式擬合。多元線性回歸擬合模型為：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3。

實(shí)際方程為：Y1=+0.143 65+1.173 87E-003X1+0.033 053 X2-1.11301E-003X3(相關(guān)系數(shù)R=0.089，F(xiàn)=4.00，Df=16，P=0.066 8，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=0.080)。由模型方程參數(shù)F=4.00，Df= (5，11)，P值=0.066 8＞0.05，可以看出，方程的擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差。

Y2=0.059 096+7.664 54E-004X1+ 2.09016E-003X2-6.46398E-004X3(相關(guān)系數(shù)R=3.638E-003，F(xiàn)=0.53，Df= (11，16)，P=0.8249，調(diào)整后的相關(guān)系數(shù)Ra=1.954E-003)。由模型方程參數(shù)F=4.00，Df=16，P=0.8249＞0.05，可以看出，方程的擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差。

二次多項(xiàng)式回歸擬合模型為：Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X12+b5X22+b6X32+b7X1X2+b8X2X3+b9X1X3

實(shí)際方程為：Y1=0.58411-0.053396X1+0.26635X2+0.014 489X3-3.17345E-003X1X2-37583E-004X1X3+ 1.52336E-003X2X3+6.92817E-004X12-9.60387E-003X22(相關(guān)系數(shù)R=0.96，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=0.98，F(xiàn)=5.54，Df=(6，11)，P=0.0114)二次多項(xiàng)式相關(guān)系數(shù)R=0.96，P=0.0114＜0.05，與線性擬合相比有較大提高，說(shuō)明該方程有較高的可信度。

Y2=-3.62350E-003X1-0.019468X2-4.67639E-003X3+7.21110E-004X1X2-4.02828E-005X1X3+1.71972E-004X2X3+ 2.17933E-005X12-3.99679E-003X22-1.22226E-005X32(相關(guān)系數(shù)R=0.94，調(diào)整后相關(guān)系數(shù)Ra=0.95，F(xiàn)=14.38，Df=(6，11)，P=0.0051)二次多項(xiàng)式復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.94，P=0.0051＜0.05，與線性擬合相比有較大提高，說(shuō)明該方程有較高的可信度。

4.2 工藝優(yōu)化 根據(jù)二次多項(xiàng)式方程，繪制各考察指標(biāo)與另外兩個(gè)試驗(yàn)因素的三維反應(yīng)曲面關(guān)系圖，以歐前胡素為例，結(jié)果見(jiàn)圖2—4。

圖2 歐前胡素(Y1)提取率對(duì)甲醇濃度和提取時(shí)間的三維效應(yīng)面圖

圖3 歐前胡素(Y1)提取率對(duì)甲醇濃度和甲醇用量的三維效應(yīng)面圖

圖4 歐前胡素(Y1)提取率對(duì)提取時(shí)間 和甲醇用量的三維效應(yīng)面圖

4.3 工藝驗(yàn)證 為驗(yàn)證所建立的數(shù)學(xué)模型，分別針對(duì)歐前胡素和異歐前胡素各選擇3組不同條件的平行試驗(yàn)，得到的實(shí)測(cè)值與數(shù)學(xué)模型得到的預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與實(shí)際值偏差較小顯示方程預(yù)測(cè)性很好，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 工藝驗(yàn)證

5 結(jié)果與討論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是二元多因素五水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［8-12］。常常被用來(lái)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。它是目前國(guó)外使用較廣泛的一種優(yōu)化設(shè)計(jì)方法，該實(shí)驗(yàn)是由2次的因子實(shí)驗(yàn)、2次的軸實(shí)驗(yàn)和計(jì)算出的中點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組成［13-16］。根據(jù)實(shí)際情況，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖直接選取最大提取率各因素最佳取值：歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度83.17%，提取時(shí)間為9.15小時(shí)，甲醇用量為147.32mL；異歐前胡素的最佳提取工藝為甲醇濃度91.83%，提取時(shí)間為9.15小時(shí)，甲醇用量為112.68mL。

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AlcoholExtraction of Im peratorin and Isoim peratorin from Selected Baizhiby CCD and RSM

LIJing,LU Shasha
Zhangye Hospital of Chinese Medicine,Zhangye 734000,China

Objective:To collect the extracting parameters of the alcohol from Baizhi(angelica dahurica)by central composite design(CCD)and response surfacemethod(RSM).Methods:The HPLCmethod was performed and the detected conditionswere defined,chromatography column:Waters'Sunfire C18(150mm×4.6mm,5μm); mobile phase:CHOH/H2O=70/30,isocratic elution;flow rate:0.9m L/m in;detection wavelength:254 nm;column temperature:30℃;analyzing time:20min;injection volume:10μL.Results:The bestconcentration ofmethanol for extracting the imperatorin from Baizhi was83.17%,the extracting timewas9.15 hoursand themethanoldosagewas 147.32m L，while forextracting the isoimperatorin the bestconcentration ofmethanolwas91.83%w ith 9.15 extracting hours and 112.68 m Lmethanol dosages.Conclusion:Themethod of combining CCD and RSM is easier and more accurate foroptim izing the extracting process.

Baizhi;imperatorin;isoimperatorin;CCD;RSM

R259

A

1004-6852(2015)02-0023-04

2014-07-10

李靖(1979—)，男，主管藥師。研究方向：中藥提取。