任連升，郝建兵，張蕾，郝麗榮

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)二科和血液透析中心，黑龍江 哈爾濱 150001)

醛固酮在腹膜透析大鼠腹膜纖維化中的作用*

任連升，郝建兵，張蕾△，郝麗榮

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)二科和血液透析中心，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的:研究醛固酮在腹膜透析大鼠腹膜纖維化中的作用，以及醛固酮受體拮抗劑是否能夠減輕腹膜纖維化。方法:通過腹腔注射脂多糖(第1、3、5、7天，0.6 mg/kg)+透析液(每天腹腔注射4.25%含糖透析液100 mL/kg)建立伴有腹膜纖維化的腹膜透析大鼠模型。同時給予醛固酮受體拮抗劑(螺內(nèi)酯，100 mg·kg－1· d－1)灌胃。4周后取大鼠腹膜行病理和免疫組化檢測，同時采用real－time PCR和Western blot法檢測醛固酮合成酶(CYP11B2)、11β－羥基類固醇脫氫酶2型(11β－HSD2)、鹽皮質(zhì)激素受體(MCR)和炎癥因子的表達情況。結(jié)果:成功建立伴有腹膜纖維化的腹膜透析大鼠模型，發(fā)現(xiàn)腹膜間皮細胞受損，形態(tài)改變，膠原纖維沉積，腹膜增厚，腹膜和腹透液中巨噬細胞浸潤增多。與正常大鼠相比，腹膜上MCR、11β－HSD2和CYP11B2表達增高，醛固酮含量增多。同時腹膜上NF－κB/MCP－1表達增加。而給予螺內(nèi)酯治療后腹膜纖維化減輕，NF－κB/MCP－1表達減少。結(jié)論:局部產(chǎn)生的醛固酮可能通過NF－κB/MCP－1途徑參與腹膜纖維化過程。醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯能夠減輕腹膜透析大鼠的腹膜纖維化程度。

腹膜纖維化;醛固酮;螺內(nèi)酯

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是一種有效治療終末期腎臟病的方法。但在長期維持性腹膜透析過程中由于腹膜纖維化導致超濾功能喪失，腹膜透析失敗。因此研究腹膜纖維化的發(fā)病機制對于防治和延長腹膜壽命具有重要作用。既往許多研究表明局部腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)(renin－angioten－sin－aldosterone system，RAAS)的激活在許多組織器官纖維化中發(fā)揮重要作用，并且已證明血管緊張素與腹膜纖維化相關(guān)［1－3］。然而局部醛固酮是否以及如何參與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。因此，本研究通過建立腹膜透析大鼠纖維化模型來探討醛固酮在腹膜纖維化中的作用。

材料和方法

1 動物

健康雄性SD大鼠，體重200～250 g，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院動物中心提供。每籠5只，飼養(yǎng)在恒溫(22±2)℃、恒濕(55±5)%條件下，標準飼料和自由飲水。

2 主要試劑

兔抗鼠NF－κB(p65)、單核細胞趨化蛋白－1 (monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1)、醛固酮合成酶CYP11B2、11β－羥基類固醇脫氫酶2型(11βhydroxysteroid dehydrogenase type 2，11β－HSD2)、鹽皮質(zhì)激素受體(mineralcorticoid receptor，MCR)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和CD68/ED－1多克隆抗體購自Santa Cruz;山羊抗兔Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司;RNeasy Mini提取試劑盒為Qiagen產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Life Technologies產(chǎn)品;SYBR染料(TaKa－Ra);其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

3 主要方法

3.1 動物模型制備及分組健康雄性SD大鼠30只，隨機分為3組，每組10只，正常組(control)、模型組(PD)和螺內(nèi)酯(spironolactone)組(PD－S)。模型組和螺內(nèi)酯組每日腹腔內(nèi)注射4.25%透析液(100 mL/kg)，并在第1、3、5、7天腹腔注射脂多糖(0.6 mg/kg)，注射部位固定在左下腹。螺內(nèi)酯組同時給予螺內(nèi)酯(100 mg/kg)灌胃［4］。

3.2 標本留取10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹腔內(nèi)注射4.25%透析液(100 mL/kg)，輕揉按摩大鼠腹部以使腹透液均勻地充滿腹腔。1 h后沿腹白線剪開腹壁，用滅菌吸管吸腹水1 mL注于EDTA試管中留取做腹水檢測。于右側(cè)腹壁取壁層腹膜，用冰生理鹽水沖洗后，部分甲醛固定，其余液氮速凍儲存待測。取腹透液0.1 mL于血細胞計數(shù)板中測定細胞總數(shù)，部分標本4℃離心，沉淀涂片，瑞氏－姬姆薩染色后進行細胞分類，計算單核巨噬細胞的絕對數(shù)量。心臟取血，加入預(yù)先加有肝素的試管內(nèi)離心，分離血漿－80℃冰箱儲存。待測所有實驗數(shù)據(jù)用大鼠處死時體重校正。

3.3 組織病理檢查取石蠟包埋的腹膜組織，HE及Masson三色染色，光鏡下觀察病理改變。HPIAS－1000分析軟件測量壁層腹膜厚度和膠原纖維面積。

3.4 免疫組化實驗免疫組化法分析石蠟切片，3%過氧化氫孵育10 min，血清封閉，兔抗大鼠FN和ED－1抗體室溫孵育1 h，滴加山羊抗兔II抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，封片。免疫組化圖像分析應(yīng)用彩色病理圖像免疫組化測量系統(tǒng)(HPIAS－1000)分析結(jié)果，隨機取10個視野，測定平均積分吸光度值，計算巨噬細胞個數(shù)。

3.5 Real－time PCR實驗按照總RNA提取試劑盒說明提取腹膜組織中RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，建立20 μL反應(yīng)體系，利用Roche Light Cycler 480 II系統(tǒng)進行real－time PCR，SYBR染料相對定量檢測mRNA。引物序列如下:CYP11B2 (sense:5'－AACACTGCCGAGCTCAAGAT－3'，antisense:5'－CATCGGCTTGAGAAAAGGAG－3'，產(chǎn)物162 bp);MCR(sense:5'－ATGCAGTTAATGCCCCACTC－3'，antisense:5'－TTCCTTATTGGGGTCAGCAC－3'，產(chǎn)物166 bp);11β－HSD2(sense:5'－GAGAGGATGCTACAGACCACTTC－3'，antisense:5'－TGCCAACAACCAGACAAATACA－3'，產(chǎn)物199 bp);β－actin(sense: 5'－CGCCAACCGCGAGAAGAT－3'，antisense:5'－CGTCACCGGAGTCCATCA－3'，產(chǎn)物168 bp)。PCR過程按SYBR染料說明書在熒光定量儀上進行。

3.6 Western blotting實驗提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量。各取30 μL樣品上樣進行SDS－PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入I抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次。加入II抗37℃孵育45 min，TBST洗滌3次，ECL試劑盒進行化學發(fā)光檢測。

3.7 醛固酮含量測定取血漿1 mL，壁層腹膜約50 mg，置于1.5 mL EP管內(nèi)，采用放射免疫法測定血漿和壁層腹膜中的醛固酮含量。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件包分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差(One－way ANOVA)分析，采用LSD法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 實驗組大鼠存活狀態(tài)

在預(yù)實驗過程中發(fā)現(xiàn)大鼠在注射脂多糖后死亡率較高，模型建立成功后，大鼠的狀態(tài)相對穩(wěn)定，無死亡。因此在建立模型時隨機選用40只大鼠(模型組和螺內(nèi)酯組各20只)給予腹腔注射脂多糖，1周后模型組大鼠死亡8只，螺內(nèi)酯組死亡6只。最后每組隨機選擇10只大鼠繼續(xù)實驗過程，到實驗結(jié)束均無死亡。

2 組織學改變

光學顯微鏡下觀察，正常大鼠壁層腹膜很薄，由一層線性扁平間皮細胞組成，而大網(wǎng)膜幾乎沒有炎癥細胞浸潤。模型組壁層腹膜間皮細胞變?yōu)閳A形、柱形，出現(xiàn)壞死脫落，間皮細胞下基質(zhì)明顯增厚，大量成纖維樣細胞及單核、巨噬細胞浸潤，膠原蛋白過度沉積，大網(wǎng)膜內(nèi)也出現(xiàn)大量的炎癥細胞浸潤。而螺內(nèi)酯給藥組大鼠壁層腹膜損傷減輕，基質(zhì)炎癥細胞浸潤和膠原蛋白沉積明顯減少，見圖1、表1。

Figure 1.Histological images of the peritoneum(×200).A～C:hematoxylin－eosin(HE)staining of peritonium; D～F:HE staining of colic omentum.圖1 腹膜組織學改變

表1 大鼠壁層腹膜中的膠原纖維面積Table 1.The areas of the fibroconnective tissue under the mesothelial cell layer(μm2.Mean±SD.n=10)

3 腹透液中細胞總數(shù)和單核巨噬細胞計數(shù)

正常組腹透液中的細胞總數(shù)較少，而模型組腹透液中的細胞總數(shù)和單核巨噬細胞計數(shù)顯著高于對照組(P＜0.01)，螺內(nèi)酯給藥組則較模型組顯著減少(P＜0.01)，見表2。

表2 腹透液中細胞總數(shù)和巨噬細胞數(shù)量Table 2.Macrophages in the peritoneal fluid(×108/L.Mean± SD.n=10)

4 壁層腹膜中單核巨噬細胞(ED-1陽性細胞)浸潤

通過免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組壁層腹膜中單核巨噬細胞(ED－1陽性細胞)浸潤顯著增加。螺內(nèi)酯給藥組的炎癥細胞浸潤明顯減少。定量分析表明，螺內(nèi)酯組單核巨噬細胞(ED－1陽性細胞)浸潤明顯低于模型組和正常組，見圖2、表3。

Figure 2.Infiltration of macrophages in the peritonium following immunohistochemical staining(×200).The macrophages were identified by immunohistochemical staining of ED－1(brown).A:control group;B:PD group;C:PD－S group.圖2 ED-1陽性巨噬細胞在壁層腹膜中浸潤

5 壁層腹膜CYP11B2、11β-HSD2和MCR的表達情況

Real－timePCR和Westernblotting檢測CYP11B2、11β－HSD2和MCR的mRNA和蛋白表達發(fā)現(xiàn)，在正常腹膜間皮細胞中僅有少量表達，而在模型組表達顯著增加。與模型組相比，使用螺內(nèi)酯后CYP11B2和11β－HSD2表達呈現(xiàn)下降趨勢，而MCR變化不明顯，見圖3。

Figure 3.The expression of MCR，11β－HSD2 and CYP11B2 at mRNA and protein levels in the abdominal membrane.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs PD group.圖3 MCR、11β-HSD2和CYP11B2在壁層腹膜中的表達

6 壁層腹膜上NF-κB、MCP-1和FN的表達情況

正常大鼠的壁層腹膜上NF－κB、MCP－1和FN呈弱表達。半定量分析表明模型組大鼠壁層腹膜上NF－κB和MCP－1表達顯著增加，并且MCP－1主要在間皮細胞中表達。給予螺內(nèi)酯治療后NF－κB和MCP－1表達明顯減少。FN主要沉積在間皮細胞間和細胞下基質(zhì)，模型組顯著增加，使用螺內(nèi)酯后FN表達減少，見圖4、5和表3。

Figure 4.The protein expression of NF－κB and MCP－1 in the abdominal membrane.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs PD group.圖4 NF-κB和MCP-1在壁層腹膜中的表達

Figure 5.Immunohistochemical staining of FN(brown)on formalin－fixed paraffin－embedded sections(×200).圖5 纖維連接蛋白在壁層腹膜中的表達

表3 大鼠壁層腹膜中巨噬細胞浸潤和FN表達情況Table 3.Macrophage infiltration and the expression of FN in theabdominal membrane of rats(Mean±SD.n=10)

表4 大鼠血漿和壁層腹膜中的醛固酮含量Table 4.The level of aldosterone in the peritoneum and plasma (Mean±SD.n=10)

7 血漿和壁層腹膜中醛固酮的含量

正常大鼠的壁層腹膜中含有醛固酮，但含量很少。與正常組比較，模型組大鼠壁層腹膜醛固酮含量明顯升高，而給予螺內(nèi)酯后壁層腹膜中醛固酮含量明顯降低。但是各組間血漿醛固酮含量差異無統(tǒng)計學意義，見表4。

討論

腹膜纖維化是維持性腹膜透析的主要并發(fā)癥之一，并最終導致腹膜透析失敗。而反復(fù)發(fā)生的腹膜炎癥是導致腹膜纖維化的主要原因。研究表明腹膜中浸潤的白細胞和單核巨噬細胞能夠釋放氧自由基、蛋白酶、前列腺素、白三烯和細胞因子(TGF－β1、TNF－α、IL－1β、MCP－1和RANTES)等，這些物質(zhì)進一步損害腹膜間皮的細胞，破環(huán)腹膜完整性，最終導致纖維化和功能喪失［5］。本實驗通過模擬長期腹膜透析合并間歇性炎癥刺激的腹膜纖維化大鼠模型，探討腹膜纖維化機制。

既往研究證實醛固酮可以通過基因或非基因途徑導致組織器官纖維化(心臟、腎臟等)，并且其主要作用是通過鹽皮質(zhì)激素受體實現(xiàn)的。而鹽皮質(zhì)激素受體存在于多種細胞中，與糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素具有相同的親和力。正常血液中皮質(zhì)醇的濃度是醛固酮的1 000多倍，為保證鹽皮質(zhì)激素效應(yīng)的敏感性，某些細胞中還存在一種糖皮質(zhì)激素代謝的關(guān)鍵酶11β－Hsd2，可以促進有活性的皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為可的松，顯著降低有活性的糖皮質(zhì)激素濃度。這種酶主要在鹽皮質(zhì)激素靶組織(如腎臟和結(jié)腸)中表達，保護鹽皮質(zhì)激素受體的作用［6］。因此，只有在鹽皮質(zhì)激素受體和11β－Hsd2高水平表達的組織，鹽皮質(zhì)激素才能發(fā)揮作用。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)腹膜纖維化大鼠腹膜中MCR和11β－Hsd2表達明顯增加，表明鹽皮質(zhì)激素參與了腹膜纖維化過程。越來越多的研究表明RAAS系統(tǒng)尤其是醛固酮參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，并且已經(jīng)證實醛固酮(鹽皮質(zhì)激素)的合成分為經(jīng)典的腎上腺途徑和腎上腺外局部合成途徑，后者以旁分泌和自分泌的方式在局部發(fā)揮作用。因此局部RAAS系統(tǒng)直接參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，而且CYP11B2是醛固酮合成過程的一種關(guān)鍵酶。我們研究發(fā)現(xiàn)纖維化的腹膜組織上CYP11B2表達顯著上調(diào)，并且腹膜組織中的醛固酮含量明顯增加，從而表明局部醛固酮活性增加，同時伴有腹膜纖維化，應(yīng)用螺內(nèi)酯后，腹膜纖維化減輕。因此，我們認為醛固酮可能在腹膜纖維化中發(fā)揮重要作用。

醛固酮究竟通過何種途徑參與組織器官的纖維化過程呢?有研究表明醛固酮可以在心臟組織通過NF－кB途徑誘導MCP－1表達從而導致纖維化［7］。而螺內(nèi)酯(醛固酮受體拮抗劑)能夠通過抑制TGF－β1、MCP－1和ROS過度表達，延緩心臟和腎臟纖維化的進展［8－10］。NF－κB上調(diào)MCP－1表達，誘導單核/巨唾細胞的浸潤及激活，促進炎癥反應(yīng)，進而導致纖維化。因此，我們推測NF－κB/MCP－1可能參與了腹膜纖維化過程。我們研究發(fā)現(xiàn)纖維化的腹膜上NF－κB和MCP－1表達顯著上調(diào)，腹膜和腹透液中的巨噬細胞顯著增加。螺內(nèi)酯組大鼠腹膜上的NF－κB和MCP－1表達減少，巨噬細胞浸潤減少，并且纖維化程度也減輕。既往研究表明急性和慢性炎癥均可誘導巨噬細胞局部浸潤激活導致組織損傷［11］。Vernon等［12］研究腎臟纖維化時發(fā)現(xiàn)腎臟組織中浸潤活化的巨噬細胞腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，我們推測巨噬細胞可能通過產(chǎn)生炎癥因子進一步誘導巨噬細胞浸潤活化導致間皮細胞損傷，最終導致腹膜纖維化。

綜上所述，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腹膜組織中醛固酮含量、MCR和11β－HSD2表達明顯增加，NF－κB/MCP－1上調(diào)，巨噬細胞浸潤增加，纖維化程度加劇，而預(yù)先給予螺內(nèi)酯后腹膜纖維化程度減輕。這些結(jié)果表明腹膜中RAAS系統(tǒng)激活參與了腹膜纖維化過程，局部醛固酮通過NF－κB/MCP－1途徑誘導激活炎癥細胞，導致腹膜纖維化。

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Effect of aldosterone on rat peritoneal fibrosis induced by peritoneal dialysis

REN Lian－sheng，HAO Jian－bing，ZHANG Lei，HAO Li－rong

(Department of Nephrology and Hemodialysis Center，The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China.E-mail:zhllb1996@163.com)

AIM:To investigate the pathologic role of aldosterone and protective effect of aldosterone receptor antagonist on peritoneal fibrosis in peritoneal dialysis rats.METHODS:A peritoneal fibrosis rat model was established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide(at 1 d，3 d，5 d and 7 d，0.6 mg/kg)and dialysate(daily intraperitoneal injection of 4.25%dialysate，100 mL/kg).At the same time，spironolactone(an aldosterone receptor antagonist，100 mg ·kg－1·d－1)was given to the model rats.After 4 weeks，the expression of aldosterone synthase CYP11B2，11β－h(huán)ydroxysteroid dehydrogenase type 2(11β－HSD2)，mineralocorticoid receptor(MCR)，and inflammatory factors were detected by immunohistochemistry，real－time PCR and Western blotting.RESULTS:The rat model of peritoneal fibrosis was successfully established.At the same time，the injury of mesothelial cells，deposition of collagen fibers and thickness of peritoneal were increased.Moreover，the infiltration of macrophages in the peritoneum/dialysate was increased.The level of aldosterone and the expression of MCR，11β－HSD2 and CYP11B2 in fibrotic peritoneum were obviously up－regulated as compared with normal rats.The expression of NF－κB/MCP－1 was also increased.However，treatment with spironolactone alleviated peritoneal fibrosis and reduced the expression of NF－κB/MCP－1.CONCLUSION:Local aldosterone is involved in the process of peritoneal fibrosis via NF－κB/MCP－1 pathway.Spironolactone alleviates peritoneal fibrosis of peritoneal dialysis.

Peritoneal fibrosis;Aldosterone;Spironolactone

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.024

1000－4718(2015)02－325－06

2014－07－11

2014－11－20

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院院基金資助項目(No.2012YB009)

△通訊作者Tel:0451－85555592;E－mail:zhllb1996@163.com