彭志鋒

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，山西 大同 037009)

下調(diào)microRNA-181b在小鼠缺血性腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用*

彭志鋒△

(山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，山西 大同 037009)

目的:探討microRNA－181b(miR－181b)在缺血性小鼠腦損傷病理過程中的神經(jīng)保護(hù)作用。方法:應(yīng)用N2A細(xì)胞氧－糖剝奪(OGD)模型模擬神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷;應(yīng)用小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型模擬缺血性腦損傷(成功率約60%)，原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測N2A細(xì)胞損傷程度，蛋白印跡檢測miR－181b靶蛋白自噬蛋白5(Atg5)及caspase－9的變化情況，螢光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測miR－181b對Atg5 mRNA的直接調(diào)控作用。結(jié)果:在OGD致N2A細(xì)胞缺血損傷過程中，通過上調(diào)或抑制miR－181b的表達(dá)水平可以顯著影響N2A細(xì)胞的凋亡(P＜0.05);miR－181b表達(dá)水平的改變可顯著影響Atg5蛋白表達(dá)水平(P＜0.05);共轉(zhuǎn)染miR－181b前體或miR－181b抑制劑可顯著抑制或增高含有Atg5 mRNA 3’－UTR的螢光素酶報(bào)告基因的活性(P＜0.05);MCAO后活化caspase－9的表達(dá)顯著升高，而miR－181b拮抗劑可使MCAO后剪切的caspase－9表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。結(jié)論:下調(diào)miR－181b可能通過調(diào)節(jié)Atg5的蛋白表達(dá)在缺血性小鼠腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

大腦中動(dòng)脈阻塞;氧－糖剝奪;缺血性損傷;微小RNA－181b;自噬蛋白5;N2A細(xì)胞

腦卒中是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康和生命安全的難治性疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特征。我國也是腦卒中高發(fā)大國，每年新發(fā)病200萬人，死亡約150萬人，是繼腫瘤之后導(dǎo)致城鄉(xiāng)居民死亡的第二殺手［1］。短暫或持久的局灶性腦缺血可引起一系列病理生理變化而導(dǎo)致腦損傷。由此引發(fā)的能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用、炎癥反應(yīng)、半暗帶去極化及細(xì)胞凋亡等共同參與了其病理生理變化過程［2］。因其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前臨床上對腦卒中的治療尚缺乏有效措施。

大量的研究證實(shí)，絲裂原活化蛋白激酶、PI3K/ Akt、PKA、JAK－STAT、Notch、Toll樣受體等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展過程［3－8］。然而這些信號(hào)通路不能完全闡明缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制。微小RNA(microRNAs，miRANs)作為內(nèi)源性的、非編碼的小RNA分子，至少調(diào)節(jié)細(xì)胞中30%的基因，從而引起了許多研究者的關(guān)注。近年來，越來越多的證據(jù)顯示，miRNAs在缺血性腦損傷中起著重要的作用。應(yīng)用miRNA高通量方法檢測大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型缺血再灌注后大鼠血液和腦內(nèi)的miRNA情況，鑒定出7類miRNAs，其中有些miRNAs的調(diào)節(jié)在腦缺血進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［9］。短暫的MCAO后再灌注不同時(shí)點(diǎn)成年大鼠腦內(nèi)miRNAs出現(xiàn)不同的表達(dá)情況［10］。

最近，文獻(xiàn)報(bào)道［11］通過miRNA基因芯片技術(shù)，在MCAO小鼠腦皮層篩選出差異性表達(dá)的microRNA－181b(miR－181b)。通過生物信息學(xué)分析，miR－181b有可能靶向調(diào)節(jié)自噬蛋白5(autophagy protein 5，Atg5)。然而，關(guān)于miR－181b在缺血性小鼠腦損傷中的作用，以及其是否通過調(diào)節(jié)Atg5蛋白表達(dá)水平發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。因此，本文利用N2A細(xì)胞的氧－糖剝奪(oxygen－glucose depletion，OGD)模型和MCAO致小鼠腦缺血模型，探討miR－181b在缺血性小鼠腦損傷中作用及其對Atg5蛋白表達(dá)的影響。

材料和方法

1 動(dòng)物

健康成年、雄性BALB/c小鼠，體重18～22 g，購自首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部，許可證號(hào)為SCXK－(軍) 2007－004。

2 主要試劑和儀器

胎牛血清、DMEM、OPTI－MEM I培養(yǎng)基(Gibco); Lipofectamine 2000(Invitrogen);Pre－miR－181b、AntimiR－181b(Ambion);微量注射泵(DURECT);miR－181b拮抗劑(Ribobio);兔抗Atg5多克隆抗體、鼠抗β－actin多克隆抗體(Sigma);兔抗caspase－9、cleavedcaspase－9多克隆抗體(CST);螢光檢測試劑盒(Promega);原位細(xì)胞凋亡POD檢測試劑盒(Roche)。

3 主要方法

3.1 大腦中動(dòng)脈阻塞誘導(dǎo)局部腦缺血再灌模型的制備腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.06 g/kg)麻醉小鼠，自頸部行1 cm長的正中縱切口，鈍性分離下頜下腺，暴露胸鎖乳突肌。手術(shù)顯微鏡下暴露左側(cè)頸動(dòng)脈鞘并游離出頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，小心保護(hù)與之伴行的迷走神經(jīng)，然后用5/0縫合絲線雙重結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端;在頸總動(dòng)脈上兩線結(jié)間打一松結(jié)并輕輕提起以阻斷血流，在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端的動(dòng)脈壁上用針頭扎1個(gè)小孔，將制備好的線栓從小孔插入頸總動(dòng)脈至頸內(nèi)動(dòng)脈并進(jìn)而向上到達(dá)大腦中動(dòng)脈直至遇到輕微阻力(深度約12.0 mm)，固定線栓，將下頜下腺歸位，20 min后拔出線栓，縫合皮膚。10只小鼠做MCAO手術(shù)，死亡4只小鼠，成功率約60%。假手術(shù)組(sham)只進(jìn)行手術(shù)操作，不插入線栓。

3.2 腦室給藥小鼠在缺血手術(shù)前先經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于小鼠腦立體定位儀上，局部用利多卡因局麻后行正中切口，按Paxinos的側(cè)腦室注射方法，在立體定位儀的引導(dǎo)下將腦室注射套管插入到左則腦室，然后用膠水固定，縫合傷口。接著把微量注射泵埋植在腹腔內(nèi)，通過導(dǎo)管把微量注射泵和套管連接起來。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉8×105U/d，預(yù)防感染。在小鼠MCAO前2 d持續(xù)將miR－181b拮抗劑、陰性對照(5 μmol/L，1 μL/h)注入。在微量注射泵移植前1 d，miR－181b拮抗劑及陰性對照填充到微量注射泵中37°C過夜。MCAO后24 h取出腦組織進(jìn)行相應(yīng)的分析。

3.3 OGD模型制備在5%CO2、95%O2、37°C的培養(yǎng)箱中，用含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基對N2A細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)［10］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行細(xì)胞傳代，在保證細(xì)胞達(dá)到實(shí)驗(yàn)密度并處于生長對數(shù)期的狀態(tài)下，按不同實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞。在離體細(xì)胞水平模擬缺血/再灌注刺激，采用OGD細(xì)胞模型。將N2A細(xì)胞接種于含完全培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)的96孔板中，置37℃、5%CO2、95%O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。次日將完全培養(yǎng)基更換為無糖DMEM培養(yǎng)基，并通以混合低氧氣體(5%CO2、1%O2和94%N2)。完成3 h OGD刺激后，將無糖DMEM培養(yǎng)基更換為含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基(復(fù)糖)同時(shí)，于5%CO2、95%O2(復(fù)氧)、37℃的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，離體細(xì)胞水平觀察缺血/再灌對N2A細(xì)胞的損傷情況。

3.4轉(zhuǎn)染N2A細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，將N2A細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為50%。次日使用Lipofectamine 2 000分別轉(zhuǎn)染pre－miR－181b、anti－miR－181b及相應(yīng)pre－miR對照、anti－miR對照。具體方法如下:對于每孔細(xì)胞，分別使用50 μL OPTI－MEM I培養(yǎng)基稀釋miRNA核苷酸片段和Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑，并靜置Lipofectamine 2 000稀釋液5 min?；旌舷♂尯蟮膍iRNA核苷酸片段和Lipofectamine 2 000，在室溫靜置20 min。用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)孔，鏡下觀察部分細(xì)胞略變圓，但沒有細(xì)胞懸浮。吸去PBS，緩慢加入上述混合物，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2、95%O2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);6 h后將轉(zhuǎn)染液更換為完全培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞或進(jìn)行OGD處理，通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。

3.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)取30 μg進(jìn)行SDS－PAGE分離蛋白，后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%牛奶封閉1 h后，取出并用含Tween－20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次，每次10 min。用兔抗Atg5多克隆抗體(1∶1 000)和鼠抗β－actin多克隆抗體(1∶2 000)4℃孵育3 h，PBST洗3次，每次10 min。山羊抗兔和山羊抗鼠II抗(1∶25 000)，室溫孵育1 h。PBST洗3次，每次5 min，后用化學(xué)發(fā)光掃描系統(tǒng)檢測并攝片，以β－actin為內(nèi)參照，應(yīng)用圖像分析軟件Quantity one v4.62進(jìn)行吸光度積分值分析。

3.6 原位細(xì)胞凋亡檢測經(jīng)3 h OGD/24 h復(fù)糖復(fù)氧刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;4%多聚甲醛中固定細(xì)胞1 h; PBS浸洗2次，每次5 min;蛋白激酶K(5 Mg/L)5 min;PBST 10 min;PBS浸洗2次，每次5 min;用濾紙吸去樣本區(qū)域周圍的多余液體，滴加50 μL的TdT酶反應(yīng)液于樣本區(qū)域上，于37℃、潮濕環(huán)境中反應(yīng)60 min;PBS浸洗3次，每次5 min;POD 1 h;PBS浸洗3次，每次5 min;于載玻片的樣本區(qū)域滴加100 μL DAB工作液(直到呈現(xiàn)淺棕色背景);用去離子水漂洗2～3次;用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加3滴甘油于樣本區(qū)域，然后蓋上蓋玻片進(jìn)行封片，即可在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

3.7 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測含有Atg5 mRNA 3’－UTR或突變3’－UTR(Mut)螢光素酶報(bào)告基因由廣州市銳博生物科技有限公司構(gòu)建，將該嵌合載體與Pre－miR－181b或Anti－miR－181b等共同轉(zhuǎn)染N2A細(xì)胞，接種密度為(5～6)×107/L。5%CO2、95% O2、37℃孵育48 h后，終止培養(yǎng)。應(yīng)用Promega的螢光檢測試劑盒進(jìn)行螢光強(qiáng)度測定。用螢火蟲螢光素酶為內(nèi)參照作比值，從而得出相對的螢光強(qiáng)度比，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one－way ANOVA)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 miR-181b對OGD致N2A細(xì)胞凋亡的影響

原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，pre－miR－181b可明顯增加OGD致N2A細(xì)胞的凋亡，而anti－miR－181b可使OGD處理的N2A細(xì)胞凋亡減弱(P＜0.05)，見圖1。

2 miR-181b調(diào)節(jié)Atg5蛋白的表達(dá)水平

蛋白印跡檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pre－miR－181b過表達(dá)miR－181b時(shí)，Atg5蛋白表達(dá)量顯著降低;而轉(zhuǎn)染anti－miR－181抑制miR－181b表達(dá)后，Atg5蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The effects of miR－181b on Atg5 protein levels in N2A cells determined by Western blotting.A:vehicle;B: anti－miR－181b;C:anti－miR control;D:pre－miR－181b;E:pre－miR control.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs A.圖2 miR-181b對N2A細(xì)胞Atg5蛋白的調(diào)節(jié)

3 miR-181b與Atg5 mRNA的3’-UTR相結(jié)合負(fù)性調(diào)節(jié)其翻譯

螢光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果示，pre－miR－181b顯著抑制螢光素酶活性，而轉(zhuǎn)染anti－miR－181b則螢光強(qiáng)度明顯升高(P＜0.05)，見圖3。結(jié)果表明miR－181b直接與Atg5 mRNA的3’－UTR結(jié)合，從而負(fù)性調(diào)控Atg5的蛋白表達(dá)水平。

Figure 3.The effect of miR－181b on the luciferase activities of luciferase expressing plasmid containing 3’－UTR of Atg5 mRNA.A:vehicle;B:pre－miR－181b;C:premiR control;D:anti－miR－181b;E:anti－miR control.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05 vs Mut.圖3 miR-181b對含Atg5 mRNA的3’-UTR螢光素酶表達(dá)的影響

4 miR-181b拮抗劑對活化的caspase-9的影響

MCAO后激活的caspase－9與非手術(shù)組相比顯著提高;miR－181b拮抗劑可以使MCAO后deaved caspase－9明顯減少(P＜0.05)，見圖4。結(jié)果提示miR－181b在小鼠缺血性損傷中發(fā)揮作用，抑制miR－181b可以緩解小鼠腦缺血引起的凋亡。

Figure 4.The protein levels of cleaved caspase－9 after MCAO in mice with miR－181b antagonist.A:sham;B:MCAO; C:MCAO+antagonist control;D:MCAO+miR－181b antagonist.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs C.圖4 miR-181b拮抗劑對活化caspase-9的影響

討論

本研究證實(shí)過表達(dá)miR－181b可使OGD引起的N2A細(xì)胞死亡增加，而降低miR－181b表達(dá)水平則可減輕OGD致N2A細(xì)胞的缺血損傷，其作用機(jī)制可能與負(fù)性調(diào)節(jié)Atg5蛋白表達(dá)水平相關(guān);抑制miR－181b可減輕MCAO誘導(dǎo)小鼠腦神經(jīng)元的凋亡。

缺血性腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞損傷主要表現(xiàn)為壞死和凋亡。當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，缺血中心區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞由于血流供應(yīng)的急速缺乏而迅速發(fā)生壞死性死亡;但在中心缺血區(qū)外圍，一些細(xì)胞會(huì)經(jīng)過一段時(shí)間后慢慢地死亡，這些細(xì)胞的死亡常常呈現(xiàn)凋亡特征，這種腦缺血后半影區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞缺失即為凋亡，而凋亡引起的損傷更嚴(yán)重、更持久，且在發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位［12］。因此，采取積極有效措施，阻止缺血半影區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首次提出了下調(diào)miR－181b可能是通過上調(diào)其靶基因Atg發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Atg5是自噬相關(guān)基因，敲除Atg5可導(dǎo)致小鼠自噬功能不全而于出生后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡［13］。自噬是真核生物進(jìn)化上高度保守的分級代謝方式，通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)來維護(hù)細(xì)胞代謝平衡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖［14］。陸續(xù)有研究在局灶性腦缺血、全腦缺血及低氧－缺血模型中發(fā)現(xiàn)了自噬現(xiàn)象［15］。在大鼠腦缺血模型研究中觀察到，缺血灶周圍腦組織神經(jīng)元中的溶酶體和自噬活動(dòng)均顯著增強(qiáng)，認(rèn)為自噬活動(dòng)對缺血周圍腦組織具有保護(hù)作用［16］。在低氧/缺血模型中，給予自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素能夠減少低氧/缺血損傷［17］，提示了自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用［18］，該過程的自噬可觀察到顯著的腦保護(hù)現(xiàn)象。另外還有研究報(bào)道自噬在缺血/復(fù)灌模型中通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮了神經(jīng)保護(hù)作用［19］。自噬在缺血性腦損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全明確。相關(guān)研究提示自噬通過清除損傷線粒體，即線粒體自噬，可能在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。損傷的線粒體在缺血性腦損傷過程中釋放包括細(xì)胞色素C在內(nèi)的多種蛋白，進(jìn)而誘發(fā)線粒體依賴的神經(jīng)元凋亡［20］。

［1］張婷婷，謝謙，劉騰遠(yuǎn)，等.MicroRNAs與腦卒中的研究進(jìn)展［J］.分子診斷與治療雜志，2012，4(1):1－10.

［2］Moskowitz MA，Lo EH，Iadecola C.The science of stroke:mechanisms in search of treatments［J］.Neuron，2010，67(2):181－198.

［3］Bohacek I，Cordeau P，Lalancette－Hebert M，et al.Tolllike receptor 2 deficiency leads to delayed exacerbation of ischemic injury［J］.J Neuroinflammation，2012，9:191.

［4］Hara T，Hamada J，Yano S，et al.CREB is required for acquisition of ischemic tolerance in gerbil hippocampal CA1 region［J］.J Neurochem，2003，86(4):805－814.

［5］Justicia C，Gabriel C，Planas AM.Activation of the JAK/ STAT pathway following transient focal cerebral ischemia: signaling through Jak1 and Stat3 in astrocytes［J］.Glia，2000，30(3):253－270.

［6］Noshita N，Lewen A，Sugawara T，et al.Evidence of phosphorylation of Akt and neuronal survival after transient focal cerebral ischemia in mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2001，21(12):1442－1450.

［7］Arumugam TV，Chan SL，Jo DG，et al.Gamma secretase－mediated Notch signaling worsens brain damage and functional outcome in ischemic stroke［J］.Nat Med，2006，12(6):621－623.

［8］Wang X，Wang H，Xu L，et al.Significant neuroprotection against ischemic brain injury by inhibition of the MEK1 protein kinase in mice:exploration of potential mechanism associated with apoptosis［J］.J Pharmacol Exp Ther，2003，304(1):172－178.

［9］Jeyaseelan K，Lim KY，Armugam A.MicroRNA expression in the blood and brain of rats subjected to transient focal ischemia by middle cerebral artery occlusion［J］.Stroke，2008，39(3):959－966.

［10］Dharap A，Bowen K，Place R，et al.Transient focal ischemia induces extensive temporal changes in rat cerebral microRNAome［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2009，29 (4):675－687.

［11］Liu C，Peng Z，Zhang N，et al.Identification of differentially expressed microRNAs and their PKC－isoform specific gene network prediction during hypoxic pre－conditioning and focal cerebral ischemia of mice［J］.J Neurochem，2012，120(5):830－841.

［12］Rami A，Kogel D.Apoptosis meets autophagy－like cell death in the ischemic penumbra:Two sides of the same coin?［J］.Autophagy，2008，4(4):422－426.

［13］Kuma A，Hatano M，Matsui M，et al.The role of autophagy during the early neonatal starvation period［J］.Nature，2004，432(7020):1032－1036.

［14］Zou M，Lu N，Hu C，et al.Beclin 1－mediated autophagy in hepatocellular carcinoma cells:implication in anticancer efficiency of oroxylin A via inhibition of mTOR signaling［J］.Cell Signal，2012，24(8):1722－1732.

［15］Wen YD，Sheng R，Zhang LS，et al.Neuronal injury in rat model of permanent focal cerebral ischemia is associated with activation of autophagic and lysosomal pathways［J］.Autophagy，2008，4(6):762－769.

［16］Puyal J，Clarke PG.Targeting autophagy to prevent neonatal stroke damage［J］.Autophagy，2009，5(7): 1060－1061.

［17］Carloni S，Girelli S，Scopa C，et al.Activation of autophagy and Akt/CREB signaling play an equivalent role in the neuroprotective effect of rapamycin in neonatal hypoxia－ischemia［J］.Autophagy，2010，6(3):366－377.

［18］Koike M，Shibata M，Tadakoshi M，et al.Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic－ischemic injury［J］.Am J Pathol，2008，172(2):454－469.

［19］Zhang X，Yan H，Yuan Y，et al.Cerebral ischemiareperfusion－induced autophagy protects against neuronal injury by mitochondrial clearance［J］.Autophagy，2013，9(9):1321－1333.

［20］Jemmerson R，Dubinsky JM，Brustovetsky N.Cytochrome C release from CNS mitochondria and potential for clinical intervention in apoptosis－mediated CNS diseases［J］.Antioxid Redox Signal，2005，7(9－10):1158－1172.

Down-regulation of microRNA-181b has protective effect on cerebral ischemic injury of mice

PENG Zhi－feng

(Department of Physiology，School of Medicine，Shanxi Datong University，Datong 037009，China.E-mail:pzf181@126.com)

AIM:To explore the role of microRNA－181b(miR－181b)in ischemic injury and autophagy protein 5(Atg5)levels of mice.METHODS:Oxygen－glucose depletion(OGD)model in N2A cells to mimic ischemic injury in vitro was established.A middle cerebral artery occlusion(MCAO)model to mimic ischemic injury in vivo was also induced in mice.The N2A cell apoptosis after OGD was assessed by in situ cell death detection kit.The Atg5 and caspase－9 expressions were determined by Western blotting.Luciferase reporter assay was performed to identify the direct binding of miR－181b with 3’－UTR of Atg5 mRNA.RESULTS:The alteration of miR－181b expression level by transfection with premiR－181b or anti－miR－181b significantly affected N2A cell apoptosis(P＜0.05).Accordingly，the changes of miR－181b levels significantly altered the protein level of Atg5(P＜0.05).Co－transfection of the luciferase reporters with pre－miR－181b or anti－miR－181b resulted in the inhibition or enhancement of the luciferase activities of luciferase expressing plasmid containing 3’－UTR of Atg5 mRNA(P＜0.05).In addition，the miR－181b antagonist significantly reduced the cleaved caspase－9 levels in cerebral ischemic cortex of the mice after MCAO(P＜0.05).CONCLUSION:Down－regulation of miR－181b plays an important role in ischemic injury of mice through regulating Atg5 protein level.

Middle cerebral artery occlusion;Oxygen－glucose depletion;Ischemic injury;MicroRNA－181b; Autophagy protein 5;N2A cells

R363;R338

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.006

1000－4718(2015)02－224－05

2014－08－25

2014－11－18

山西大同大學(xué)博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)

△通訊作者Tel:0352－6205665;E－mail:pzf181@126.com