李艷花，和青，尉杰忠，劉春云，黃建軍，豐玲，柴智，王青，肖保國(guó)△，馬存根，△

(1山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009;2復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025;3同煤集團(tuán)總醫(yī)院神經(jīng)外科，山西 大同 037003;4山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心，衛(wèi)生部臨床重點(diǎn)專科，山西 太原 030024)

硫辛酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響*

李艷花1，和青2，尉杰忠1，劉春云1，黃建軍3，豐玲1，柴智4，王青4，肖保國(guó)2△，馬存根1，4△

(1山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009;2復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025;3同煤集團(tuán)總醫(yī)院神經(jīng)外科，山西 大同 037003;4山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心，衛(wèi)生部臨床重點(diǎn)?？?，山西 太原 030024)

目的:探討硫辛酸(LA)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的帕金森病(PD)模型小鼠黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制。方法:10月齡雌性C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、PD模型組和LA干預(yù)組。采用鼻腔滴入LPS制作PD小鼠模型，通過爬竿實(shí)驗(yàn)及酪氨酸羥化酶和p－NF－κB/p65的免疫組化技術(shù)觀察LA對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用。結(jié)果:LPS經(jīng)鼻可以成功誘導(dǎo)小鼠PD模型，給予LA可明顯恢復(fù)小鼠運(yùn)動(dòng)，減少黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的丟失、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及其NF－κB信號(hào)通路激活。結(jié)論:LA干預(yù)可緩解LPS經(jīng)鼻誘導(dǎo)的小鼠PD行為學(xué)和病理學(xué)的改變，其作用機(jī)制可能與抑制腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

脂多糖;帕金森病;硫辛酸;小膠質(zhì)細(xì)胞

帕金森病(Parkinson disease，PD)是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的第2大神經(jīng)變性疾病，55歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)1%，在全世界范圍內(nèi)有大約650萬(wàn)患者。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia，MG)的炎癥反應(yīng)與PD之間存在著重要聯(lián)系［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是常用的促炎癥反應(yīng)物質(zhì)，可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞［2］。前期研究發(fā)現(xiàn)LPS可以通過多種途徑制備PD模型:如黑質(zhì)內(nèi)注射、體循環(huán)注射、子宮內(nèi)注射以及蒼白球內(nèi)注射等途徑，這些途徑均可以引起黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的丟失［3］。硫辛酸(lipoic acid，LA)是存在于線粒體α－酮酸氧化脫氫酶系中一個(gè)重要的輔助因子，作為強(qiáng)而有效的抗氧化劑被廣泛使用，主要通過清除體內(nèi)的氧自由基和動(dòng)員機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化劑的生成發(fā)揮作用［4－5］。除此之外，近幾年發(fā)現(xiàn)，LA也兼具抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF－κB信號(hào)通路的激活，保護(hù)DA能神經(jīng)元抵抗魚藤酮誘導(dǎo)的損傷［6］，保護(hù)神經(jīng)元抵抗低氧、谷氨酸鹽和金屬離子誘導(dǎo)的損傷［7］，保護(hù)皮層神經(jīng)元抵抗β－淀粉樣蛋白和H2O2誘導(dǎo)的損傷［8］。但LA在LPS誘導(dǎo)的PD炎癥模型中的作用及其機(jī)制仍不清楚。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

健康雌性C57BL/6小鼠，10月齡，體重22～25 g，由北京維通利華動(dòng)物有限公司提供，清潔級(jí)飼養(yǎng)，自由飲食1周。乙醚麻醉小鼠約10 s后，手持其頸部，鼻孔向上，使用微量移液器將LPS(1 g/L，溶解在生理鹽水中)緩慢滴入小鼠的鼻孔內(nèi)，并停留一會(huì)兒(大約10 s)，使藥液充分滲入，每側(cè)鼻孔10 μL。每天給予1次，持續(xù)1個(gè)月。對(duì)照組滴入相同體積的生理鹽水［9］。

2 動(dòng)物分組及LA干預(yù)

用生理鹽水將LA配制成10 g/L，在滴注LPS后的第3天開始給予，持續(xù)給藥至30 d。24只小鼠隨機(jī)分為①生理鹽水對(duì)照組saline組:鼻腔滴注生理鹽水;②PD模型組(LPS組):鼻腔滴注LPS;③LA治療組(LPS+LA組):鼻腔給予LPS，3 d后同時(shí)雙側(cè)鼻腔各給予10 μL的LA。

3 行為學(xué)觀察和標(biāo)本采集

給藥27 d時(shí)，動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，用爬竿實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。將一個(gè)直徑為1 cm，長(zhǎng)為58 cm的木桿纏繞兩層紗布，頂端固定一個(gè)方形木塞。持小鼠尾部將其放于木塞，頭部朝下，讓其自然下爬，記錄小鼠在木塞上轉(zhuǎn)頭的時(shí)間和從竿頂爬至竿底平臺(tái)的時(shí)間。正式測(cè)試之前，預(yù)先練習(xí)5次，然后測(cè)試3次，每次測(cè)試時(shí)間不超過3 min，超過3 min，以3 min記錄。連續(xù)測(cè)試3 d。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)之后，每只腹腔注射50 mg/L水合氯醛0.2 mL，生理鹽水灌流。冰上解剖，每組4只分離黑質(zhì)，制備蛋白質(zhì)勻漿，－70℃保存。其余4只用4%多聚甲醛灌注固定后，快速取腦組織，用OCT包埋制作冰凍切片(10 μm)，用于免疫熒光染色。

4 免疫熒光染色

取黑質(zhì)區(qū)腦組織切片，PBS洗3次，每次5 min，分別用稀釋于1%BSA－PBS溶液中的抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(Millipore)、抗CD11b抗體(eBioscience)、抗磷酸化(phosphorylated，p)－NF－κB/p65抗體(Cell signaling)4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min，再加入相應(yīng)的II抗，室溫孵育1.5 h，PBS洗3次，50%甘油封片。用Olympus正置熒光顯微鏡觀察各種抗體的免疫染色活性并攝片。

5 Western blotting

上述蛋白質(zhì)勻漿用BCA試劑盒檢測(cè)濃度，將濃度均調(diào)成10 g/L。每種蛋白樣品上樣80 μg，SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳1.5～2.0 h。200 mA、1.5 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入抗TH抗體，4℃孵育過夜，PBST(含0.3%吐溫的PBS溶液)洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體室溫下孵育1.5 h，PBST洗3次;ECL(Life Sciences)顯影，Bio－Rad化學(xué)發(fā)光儀采集發(fā)光信號(hào)，Image 4.0進(jìn)行灰度處理。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 5(Cabit Information Technology)，采用t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)腦組織的黑質(zhì)區(qū)腦片分別選取第5張、25張、50張和75張行TH抗體免疫熒光染色，使用IMAGE－PRO PLUS軟件對(duì)TH細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)計(jì)數(shù)，總數(shù)被用作統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

1 LA改善LPS誘導(dǎo)的PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能

在模型制備的第27天，3組動(dòng)物行爬竿實(shí)驗(yàn)，分別記錄爬竿時(shí)間和在竿頂轉(zhuǎn)頭的時(shí)間。結(jié)果顯示鼻腔給予LPS的小鼠從竿頂爬到地面平臺(tái)所需時(shí)間為(12.14±5.13)s，在竿頂轉(zhuǎn)頭的時(shí)間為(6.82± 3.25)s。然而生理鹽水對(duì)照組小鼠所需時(shí)間分別為(9.52±2.55)s、(2.23±1.30)s，2組之間差異明顯，說(shuō)明LPS明顯損害了小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能。LA治療明顯減少了小鼠到達(dá)平臺(tái)所需的時(shí)間和竿頂轉(zhuǎn)頭的時(shí)間(P＜0.05)，說(shuō)明LA能明顯改善LPS誘導(dǎo)的PD模型鼠的運(yùn)動(dòng)功能，見圖1。

Figure 1.LA improved the behavior symptoms of LPS－induced PD mice.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs LPS group.圖1 LA改善LPS誘導(dǎo)的PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能

2 LA保護(hù)黑質(zhì)區(qū)TH神經(jīng)元免受LPS損傷

黑質(zhì)區(qū)TH免疫熒光染色結(jié)果表明，3組小鼠黑質(zhì)均檢測(cè)到TH陽(yáng)性DA能神經(jīng)元，對(duì)照組TH陽(yáng)性DA能神經(jīng)元數(shù)量較多，胞體飽滿，邊緣清晰;然而LPS誘導(dǎo)的PD模型組TH陽(yáng)性DA神經(jīng)元數(shù)量較對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)，胞體輪廓模糊;LA組黑質(zhì)TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量與PD組相比明顯增加(P＜0.05)，神經(jīng)元形態(tài)清晰，與生理鹽水對(duì)照組相似，見圖2。

Figure 2.LA prevented TH－positive dopaminergic neurons in the substantia nigra(SN)from LPS－induced injury.A:immunohistochemistry of TH－positive dopaminergic neurons in the SN of mice，and quantitative analysis was done;B:Western blotting analyses of TH in protein extracts from the brain in mice，with the results expressed as the ratio of TH/GAPDH.Mean± SD.n=8.*P＜0.05 vs LPS group.圖2 LA保護(hù)黑質(zhì)區(qū)TH神經(jīng)元免受LPS誘導(dǎo)的損傷

3 LPS誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的活化

在LPS給予0 d、7 d、14 d、21 d和30 d分別處死4只小鼠，制作黑質(zhì)區(qū)腦組織切片，行p－NF－κB/ p65免疫熒光染色，結(jié)果顯示:在0 d、7 d和14 d的小鼠黑質(zhì)區(qū)僅有零星的p－NF－κB/p65染色陽(yáng)性細(xì)胞，而在21 d和30 d的小鼠腦組織中，則有大量的p－NF－κB/p65染色陽(yáng)性細(xì)胞，并與第0天處死的小鼠腦組織中p－NF－κB/p65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相比具有顯著差異，說(shuō)明LPS可能在第14天～21天期間激活了腦內(nèi)NF－κB信號(hào)通路，見圖3。

Figure 3.NF－κB signal pathway was activated on day 14～21 after LPS treatment in brain of mice.A:representative microphotographs for expression of p－NF－κB/p65 in the substantia nigra(SN)of mice;B:quantative analysis of p－NF－κB/p65 positive cells in the SN of mice.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 d.圖3 LPS在第14～21天時(shí)誘導(dǎo)小鼠腦組織NF-κB信號(hào)通路的活化

4 LA抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路激活

采用MG特異性抗體行腦片黑質(zhì)區(qū)免疫熒光染色，結(jié)果顯示:生理鹽水對(duì)照組MG為分枝樣，突起細(xì)小，無(wú)明顯胞體，染色較淺，說(shuō)明該組MG處于靜息狀態(tài)。然而，LPS誘導(dǎo)的PD模型組大量的MG表現(xiàn)為胞體變圓，突起增粗，分枝增多，染色較深等特點(diǎn)，暗示該組SN區(qū)的MG呈激活態(tài)。給予LA治療的小鼠，其SN區(qū)的MG與對(duì)照組相似，也處于靜息狀態(tài)。由此可見，LA可以抑制LPS誘導(dǎo)的MG激活。進(jìn)一步用p－NF－κB/p65的抗體標(biāo)記上述腦片發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)的PD模型組有大量的MG表達(dá)p－NF－κB/p65，而對(duì)照組和治療組則幾乎沒有p－NF－κB/ p65表達(dá)，說(shuō)明LA可以抑制MG的NF－κB信號(hào)蛋白的激活與表達(dá)，見圖4。

討論

PD是以進(jìn)行性黑質(zhì)部DA能神經(jīng)元減少為特征的神經(jīng)變性疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙，確切發(fā)病機(jī)制至今未明［9］。因此，一種理想的可以模擬PD臨床和病理特征的動(dòng)物模型對(duì)于研究PD的發(fā)病機(jī)制和治療干預(yù)顯得非常重要。目前，常用的PD動(dòng)物模型主要是一些神經(jīng)毒物模型，用于引發(fā)PD的神經(jīng)毒物主要包括6－OHDA、MPTP、百草枯、魚藤酮等［3］。然而，這些物質(zhì)誘導(dǎo)的PD模型均有局限性，如6－OHDA必須要腦內(nèi)定向注射，MPTP自然界并不存在，成模率不穩(wěn)定，毒性大。另外，這些神經(jīng)毒物的人工暴露路徑可能也不是PD患者致病的真實(shí)途徑。目前認(rèn)為PD環(huán)境毒物暴露可能包括口服和經(jīng)鼻2個(gè)途徑［3］。LPS在自然界中普遍存在，包括空氣中的塵埃、細(xì)顆粒物(particulate matter，PM)等污染物，有可能經(jīng)鼻避開血腦屏障(blood brain barrier，BBB)直接進(jìn)入腦內(nèi)誘導(dǎo)PD的發(fā)生。有研究表明，在腦室內(nèi)注射大劑量LPS，1 h之后就有小膠質(zhì)細(xì)胞激活，24 h后部分小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步激活成“阿米巴樣”，黑質(zhì)部可見一些圓形的膠質(zhì)細(xì)胞［10－11］，說(shuō)明LPS能通過激活中樞炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致PD的發(fā)生，但是這種立體定向注射技術(shù)操作難度較大，一次性給予LPS(100 μg)的濃度太高，并不能真正模擬正常的慢性炎性病理狀態(tài)，限制了該LPS誘導(dǎo)的PD模型的廣泛應(yīng)用。也有人通過腹腔注射LPS(5 mg/kg)成功誘導(dǎo)PD模型［12－13］，但是腹腔注射可引發(fā)炎癥反應(yīng)以及隨后的體液免疫反應(yīng)和肝腎功能的損害。Tonelli等［14］已證實(shí)經(jīng)鼻暴露LPS能激活嗅覺上皮細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)還導(dǎo)致嗅覺神經(jīng)元的丟失，這一現(xiàn)象可能可以用來(lái)解釋早期PD患者嗅覺減退的臨床癥狀。鼻炎增加PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，也可能與鼻炎的感染源釋放了過多的LPS相關(guān)，這些研究結(jié)果提示鼻腔LPS暴露途徑可能是一個(gè)合理制備PD模型的方法［3］。2013年，有學(xué)者通過LPS經(jīng)鼻暴露成功制備了PD模型，本研究采用LPS長(zhǎng)時(shí)間、低劑量滴鼻持續(xù)給予C57BL/6小鼠成功獲得了理想的PD動(dòng)物模型［3，9］。結(jié)果顯示鼻腔滴入LPS可以誘導(dǎo)小鼠運(yùn)動(dòng)功能改變，引發(fā)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失、激活小膠質(zhì)細(xì)胞及其NF－κB信號(hào)通路，而且還發(fā)現(xiàn)持續(xù)給予LPS至14～21 d時(shí)就能明顯地激活NF－κB信號(hào)通路。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，LA是線粒體α－酮酸氧化脫氫酶的一個(gè)輔助因子，通過清除體內(nèi)的氧自由基和動(dòng)員機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化劑的生成發(fā)揮作用［15］。具有水溶性、脂溶性和分子量小等特點(diǎn)，能容易地通過BBB［16］。最近研究發(fā)現(xiàn)LA兼具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF－κB信號(hào)通路的激活，保護(hù)皮層神經(jīng)元抵抗β－淀粉樣蛋白和H2O2的損傷［8］。膳食中補(bǔ)充LA可以抑制IL－6和TNF－α的表達(dá)［17］。通過抑制LPS對(duì)NF－κB和AP－1信號(hào)蛋白的激活，下調(diào)LPS誘導(dǎo)的NO和TNF－α的產(chǎn)生［18］。體外BV－2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示，LA通過抑制GSK－3β、PI3K和激活A(yù)kt信號(hào)通路來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［19］。LA具有保護(hù)PC12神經(jīng)元免受MPTP毒性損害的作用［20］。上述研究人員主要是通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了LA能夠明顯抑制刺激物誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及神經(jīng)損傷，然而并未有研究人員從體內(nèi)探討LA的神經(jīng)保護(hù)作用，因此本研究利用LPS經(jīng)鼻誘導(dǎo)的小鼠PD模型，采用免疫熒光染色及Western blotting技術(shù)檢測(cè)了黑質(zhì)TH數(shù)量，CD11b陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和p－NF－κB蛋白的表達(dá)情況，并結(jié)合爬竿實(shí)驗(yàn)，探討了LA對(duì)LPS所致小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。結(jié)果顯示，與PD組相比，LA可明顯恢復(fù)小鼠運(yùn)動(dòng)，減少黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及其NF－κB信號(hào)通路激活，提示LA對(duì)LPS誘導(dǎo)的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

綜上所述，我們推測(cè)LA干預(yù)可能是通過抑制NF－κB活性，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，緩解LPS經(jīng)鼻引起的小鼠PD行為學(xué)和病理學(xué)的改變。

Figure 4.LA significantly inhibited NF－κB activation in microglia.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs LPS group.圖4 LA抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路激活

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Lipoic acid protects dopaminergic neurons in LPS-induced model of Parkinson's disease

LI Yan－h(huán)ua1，HE Qing2，YU Jie－zhong1，LIU Chun－yun1，HUANG Jian－jun3，F(xiàn)ENG Ling1，CHAI Zhi4，WANG Qing4，XIAO Bao－guo2，MA Cun－gen1，4

(1Department of Neurology，Institute of Brain Science，Medical School，Shanxi Datong University，Datong 037009，China;2Institute of Neurology，Huashan Hospital，Institutes of Brain Science and State Key Laboratory of Medical Neurobiology，F(xiàn)udan University，Shanghai 200025，China;3Department of Neurosurgery，F(xiàn)irst Hospital，Datong Coalmine Group，Datong 037003，China;4"2011"Collaborative Innovation Center/Department of Encephalopathy and National Major Clinical Department of Ministry of Health，Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM:To evaluate the effect of lipoic acid(LA)on LPS－induced Parkinson disease(PD)model of mice.METHODS:Female C57BL/6 mice of 10－month－old were randomly divided into saline control group，PD group and LA group.The PD mouse model was induced by intranasal instillation of LPS.Assays of tyrosine hydroxylase，microglia and nuclear factor kappa B(NF－κB)were performed by the methods of immunohistochemistry and Western blotting.RESULTS:Intranasal LPS instillation exhibited basic characteristics of PD model.However，LA administration significantly improved motor dysfunction，protected dopaminergic neurons from damage，and inhibited NF－κB activation in inflammatory microglia in the substantia nigra area of the brain.CONCLUSION:LA may exert a profound neuroprotective effect by anti－neuroinflammatory reaction to arrest the progression of PD.

Lipopolysaccharide;Parkinson disease;Lipoic acid;Microglia

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.002

1000－4718(2015)02－201－06

2014－09－11

2014－10－12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272163);山西省青年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2012021034－2);山西大同大學(xué)博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(No.2011－B－11);山西大同大學(xué)研究所科研項(xiàng)目啟動(dòng)經(jīng)費(fèi);山西中醫(yī)學(xué)院“2011”培育計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011PY－1)

△通訊作者Tel:0351－3179809;E－mail:macungen2001@163.com