賀涓涓，洪華，楊世亮

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510630;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

阿托伐他汀對(duì)腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的保護(hù)作用*

賀涓涓1，洪華2△，楊世亮2

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510630;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

目的:研究在腦缺血再灌注(ischemia－reperfusion，IR)損傷中阿托伐他汀對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法:SD大鼠72只隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、IR組和阿托伐他汀組。阿托伐他汀組大鼠術(shù)后予以阿托伐他汀(20 mg·kg－1·d－1)灌胃治療，每天1次，連續(xù)3 d。利用線栓法制作腦IR模型，缺血2 h后再灌注72 h，對(duì)各組大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，并檢測(cè)梗死側(cè)大腦半球腦組織含水量、伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)滲出量、緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和炎癥因子磷脂酰肌醇3－激酶p110γ(PI3K－p110γ)的表達(dá)水平。結(jié)果:與假手術(shù)組相比，IR組大鼠腦組織含水量、EB的滲出量及神經(jīng)功能評(píng)分均增加(P＜0.01)，同時(shí)occludin表達(dá)下降(P＜0.01)，PI3K－p110γ表達(dá)增加(P＜0.01);而阿托伐他汀治療組大鼠腦水腫程度減輕(P＜0.01)，EB滲出量減少(P＜0.01)，occludin表達(dá)增加(P＜0.01)，PI3K－p110γ表達(dá)減少(P＜0.01)，神經(jīng)功能評(píng)分下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論:阿托伐他汀可以減輕腦IR損傷，可能與抑制炎癥反應(yīng)、增加緊密連接蛋白表達(dá)從而維持血腦屏障穩(wěn)定性有關(guān)。

腦缺血再灌注;阿托伐他汀;血腦屏障

溶栓是缺血性腦卒中急性期治療最有效的方法，但堵塞的血管再通后會(huì)引發(fā)再灌注損傷，表現(xiàn)為加重腦水腫、引起腦出血、損傷神經(jīng)元等。腦缺血再灌注(ischemia－reperfusion，IR)損傷機(jī)制復(fù)雜，最主要是由于血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞，通透性增加，血管內(nèi)的大分子物質(zhì)及有害成分滲出到腦組織內(nèi)［1］。微血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間的緊密連接(tight junction，TJ)構(gòu)成BBB的主要結(jié)構(gòu)，尤其是TJ可反映BBB通透性的改變［2］。目前對(duì)減輕腦IR損傷的藥物研究較多，其中他汀類藥物對(duì)缺血性腦卒中有比較明確的保護(hù)作用，作用機(jī)制涉及調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)表達(dá)，減少自由基產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)等［3］，但是他汀類藥物對(duì)腦IR損傷中BBB保護(hù)作用的研究尚未見報(bào)道。本文利用局灶性腦IR模型研究阿托伐他汀對(duì)BBB的保護(hù)作用，并對(duì)再灌注損傷中TJ相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和炎癥介質(zhì)磷脂酰肌醇3－激酶p110γ(phosphatidylinositol3－kinase－p110γ，PI3K－p110γ)的變化進(jìn)行研究。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的體重約230～270g的健康雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為3組，每組24只，分別為假手術(shù)(sham，S)組、腦缺血再灌注(IR)組、阿托伐他汀(atorvastatin，A)組。阿托伐他汀組給藥方法:阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥)溶于生理鹽水，配成濃度為1 g/L的混懸液，按20 mg·kg－1·d－1的量于再灌注后1 h開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d。IR組建立IR模型，予以相同體積的生理鹽水。

2 主要試劑

兔抗大鼠occludin抗體(Invitrogen);小鼠抗大鼠PI3K－p110γ抗體(Millipore);CY3標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗(MultiSciences);辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔Ⅱ抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠Ⅱ抗、ECL光化學(xué)顯色試驗(yàn)盒(Cell Signaling)蛋白定量試驗(yàn)盒(Pierce)。

3 主要方法

3.1 IR造模方法采用改良的Kouzumi線栓法制備大鼠腦IR模型，缺血2 h后再灌注72 h。大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，分離并結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈以防術(shù)中出血，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery， ICA)，并在CCA的近心端和遠(yuǎn)心端分別掛線以備用。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA，結(jié)扎CCA近心端并在CCA近心端剪開一小口，將線頭直徑為(0.34± 0.02)mm的尼龍線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司)從剪口處順著ICA方向插入，松開動(dòng)脈夾前先將CCA遠(yuǎn)心端的掛線打一活結(jié)以防出血，繼續(xù)往前插入線栓，確認(rèn)線栓成功插入至大腦中動(dòng)脈近端后再扎緊CCA遠(yuǎn)心端活結(jié)，縫合切口。線栓頭端距頸總動(dòng)脈分叉處約18～20 mm。缺血2 h后將線栓緩慢撥出約10 mm，使頭端撤回至頸內(nèi)動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅分離動(dòng)脈，不行結(jié)扎缺血操作。

3.2 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分參照經(jīng)典的Zea Longa法進(jìn)行評(píng)分。0分:無神經(jīng)功能缺損;1分:對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能活動(dòng)，意識(shí)障礙。1～3分者納為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者不納入實(shí)驗(yàn)。

3.3 腦組織含水量測(cè)定在大鼠腦缺血2 h再灌注72 h后處死，取出梗死側(cè)大腦半球，先稱濕重，再置于100℃烤箱內(nèi)烤至恒重，稱其干重，根據(jù)下列公式計(jì)算腦組織含水量:腦組織含水量=(濕重－干重) ÷濕重×100%。

3.4 伊文思藍(lán)(evans blue，EB)滲出量測(cè)定生理鹽水配制2.5%EB，按2 mL/kg的量于大鼠處死前1 h經(jīng)股靜脈給藥，1 h后經(jīng)左心室灌注生理鹽水(2 mL/kg)，然后斷頭取腦，取出梗死側(cè)大腦半球后先稱重，而后放入甲酰胺溶液(0.1 mL/g)于60℃孵育24 h。在分光光度計(jì)上測(cè)定623 nm處已知不同濃度EB的吸光值(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組大鼠腦組織中EB含量。

3.5 免疫熒光法測(cè)定梗死灶周圍occludin陽性血管計(jì)數(shù)腦缺血2 h再灌注72 h后將各組大鼠斷頭取腦，在視交叉前后1 cm處冠狀取材，OTC包埋，冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，厚度為10 μm。加入兔抗大鼠occludin抗體(1∶100)，4℃過夜，第2天用0.01 mol/L的PBS沖洗3遍，并滴加CY3標(biāo)記的山羊抗兔的Ⅱ抗，室溫下孵育1 h，PBS沖洗3遍。每個(gè)腦取5張切片，每張切片取5個(gè)視野，Olympus BX51熒光顯微鏡下放大200倍觀察梗死灶周圍皮層中occludin陽性血管并計(jì)數(shù)，求其平均值。

3.6 Occludin和PI3K－p110γ蛋白表達(dá)的定量分析腦缺血2 h再灌注72 h后將各組大鼠斷頭取腦，冰上分離梗死側(cè)大腦半球額頂區(qū)梗死灶皮質(zhì)約100 mg，加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑，研磨勻漿后離心，取上清液，測(cè)總蛋白濃度，并保存于－80℃。用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量，每孔加樣品總蛋白量100 μg，SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂牛奶封閉1 h，分別加入兔抗大鼠occludin(1∶100)和小鼠抗大鼠PI3K－p110γ (1∶1000)的Ⅰ抗，4℃孵育過夜，第2天加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔Ⅱ抗和抗小鼠Ⅱ抗，室溫孵育1 h，ECL光化學(xué)顯色，拍片。以β－actin作為內(nèi)參照，膠片經(jīng)掃描儀掃描后獲得圖像測(cè)量分析并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，正態(tài)分布資料的組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法;非正態(tài)分布資料的組間比較采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 腦缺血2 h再灌注72 h的病理改變

大鼠腦缺血2 h后再灌注72 h，與假手術(shù)組相比較，IR組的神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及EB滲出量明顯增加(P＜0.01);伴有梗死灶周圍occludin陽性血管計(jì)數(shù)下降(P＜0.01)、梗死灶皮層occludin表達(dá)下降(P＜0.01)及PI3K－p110γ表達(dá)增加(P＜0.01)，見圖1、圖2及表1。

2 阿托伐他汀治療后BBB通透性的改變

再灌注72 h，阿托伐他汀治療組大鼠腦組織含水量及EB滲出量均比IR組大鼠減少(P＜0.01)，梗死灶周圍occludin陽性血管計(jì)數(shù)增加(P＜0.01)，而2組神經(jīng)功能評(píng)分相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見圖1、表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、梗死側(cè)大腦半球腦組織含水量及EB含量、梗死灶周圍occludin陽性血管計(jì)數(shù)的比較Table 1.Comparisons of neurological function scores，water and EB contents of brain tissue in ischemic hemisphere，and the numbers of occludin－positive vessels in ischemic boundary zone in different groups(Mean±SD)

＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs ischemia－reperfusion group.

3 各組大鼠梗死灶皮層occludin和PI3K-p110γ表達(dá)水平的變化

缺血2 h再灌注72 h，IR組大鼠occludin蛋白的表達(dá)量下降為假手術(shù)組的54.28%，PI3K－p110γ的表達(dá)量增加為假手術(shù)組的1.79倍;而使用阿托伐他汀治療后，occludin蛋白的表達(dá)量較IR組增加，PI3K－p110γ的表達(dá)量較IR組下降，見圖2。

討論

TJ由多種TJ相關(guān)蛋白組成，如occludin、claudins、閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens－1，ZO－1)等，大量研究表明腦缺血時(shí)TJ相關(guān)蛋白表達(dá)下降，分布改變［4］，相關(guān)機(jī)制主要涉及蛋白磷酸化、鈣失調(diào)、氧化損傷、炎癥反應(yīng)等［5］。Occludin是很重要的一類跨膜蛋白，在腦微血管內(nèi)皮上高度表達(dá)，有研究認(rèn)為occludin的變化可反映TJ的完整性［6］。趙紅等［7］對(duì)局灶性腦缺血(2 h)再灌注大鼠occludin蛋白表達(dá)變化的研究發(fā)現(xiàn)，與再灌注0 h相比，再灌注4 h、12 h、24 h、48 h和72 h occludin蛋白表達(dá)顯著降低，以72 h為最明顯。因此我們選擇再灌注72 h作為觀察時(shí)點(diǎn)。

我們發(fā)現(xiàn)，腦IR可導(dǎo)致BBB上occludin表達(dá)下降，伴隨有炎癥因子PI3K－p110γ表達(dá)增加;而使用阿托伐他汀治療后occludin表達(dá)增加，PI3K－p110γ表達(dá)下降，與梗死側(cè)大腦半球的腦水腫程度減輕、EB滲出減少一致，提示上調(diào)TJ相關(guān)蛋白的表達(dá)以及抑制炎癥因子PI3K－p110γ的表達(dá)可能是阿托伐他汀保護(hù)BBB、減輕腦水腫的作用機(jī)制之一。另外我們觀察到阿托伐他汀不僅能增強(qiáng)梗死灶皮層occludin蛋白的表達(dá)，也能增加梗死灶周圍occludin陽性血管計(jì)數(shù)，說明阿托伐他汀對(duì)TJ的保護(hù)作用不僅限于缺血核心區(qū)，它還能增強(qiáng)缺血半暗帶BBB的穩(wěn)定性。

羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑——他汀類藥物具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊及抑制血小板等多效作用［8］，但對(duì)調(diào)節(jié)BBB功能的研究尚少。在原代培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究者發(fā)現(xiàn)匹伐他汀可上調(diào)TJ蛋白claudin－5的表達(dá)，增強(qiáng)內(nèi)皮屏障的完整性［9］;在外傷性顱腦損傷動(dòng)物模型，研究者發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可增加claudin－5的表達(dá)并減少細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，減少白細(xì)胞滲出和腦水腫［10］。我們對(duì)大鼠腦IR模型的研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可增加occludin的表達(dá)，并降低PI3K－p110γ的表達(dá)，減輕腦水腫程度，改善神經(jīng)功能評(píng)分，是對(duì)他汀類藥物多效性研究的補(bǔ)充。此外，目前對(duì)他汀類藥物腦保護(hù)作用的研究多在術(shù)前3 d或14 d開始予以他汀類藥物預(yù)處理，我們的研究選擇在大鼠腦IR發(fā)生后予以阿托伐他汀灌胃治療，每天1次，連續(xù)3 d，更接近臨床治療模式，并且與現(xiàn)有臨床研究結(jié)論一致:他汀類藥物不僅對(duì)缺血性腦卒中有一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防作用，對(duì)急性腦卒中也有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用［11－12］。

PI3Kγ是近來發(fā)現(xiàn)的與啟動(dòng)炎癥反應(yīng)、改變BBB通透性密切相關(guān)的一個(gè)因子，它由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p101、p84或p87組成，正常情況下腦組織內(nèi)有少量表達(dá)，在腦缺血后表達(dá)量明顯增加［13］。目前的研究發(fā)現(xiàn)PI3Kγ在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中起重要作用，與動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管事件密切相關(guān)相關(guān)［14］。對(duì)PI3K-p110γ基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)PI3Kγ在腦缺血損傷中發(fā)揮重要作用，與野生型小鼠相比，PI3K-p110γ基因敲除小鼠的腦梗死體積和EB滲出明顯減輕，緊密連接蛋白claudin－5和基底膜蛋白的表達(dá)增多，同時(shí)炎癥因子基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase－9，MMP－9)表達(dá)減少［15］。這提示PI3Kγ對(duì)BBB的通透性和TJ的調(diào)節(jié)起重要作用，可能成為卒中治療的新靶點(diǎn)。但occludin與PI3Kγ表達(dá)的變化是否存在因果關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在腦IR損傷模型我們發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀干預(yù)后，BBB通透性下降、腦水腫程度減輕、occludin蛋白表達(dá)增加而PI3K－p110γ表達(dá)減少，提示對(duì)于臨床上有溶栓指針的患者，服用阿托伐他汀可保護(hù)BBB、減輕腦水腫。另外我們發(fā)現(xiàn)腦IR損傷導(dǎo)致大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加，但使用阿托伐他汀治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究樣本量較小，僅選擇Zea Longa評(píng)分1～3分者納入實(shí)驗(yàn)作為觀察對(duì)象有關(guān)。

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Protective effect of atorvastatin on blood brain barrier in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury

HE Juan－juan1，HONG Hua2，YANG Shi－liang2

(1Department of Rehabilitation，The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China;2Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:hhsums@126.com)

AIM:To explore the protective effects of atorvastatin on blood brain barrier(BBB)in cerebral ischemia－reperfusion(IR)injury and the potential mechanisms involved.METHODS:SD rats were divided into sham group，IR group and atorvastain group.Intraluminal suture method was used to establish cerebral IR model，and the ischemic brain was reperfused for 72 h after the occlusion.The rats in atorvastatin group were administered with atorvastatin(20 mg·kg－1·d－1)by gavage once a day for 3 consecutive days after operation.At 72 h after reperfusion，neurological function scores，the water content of the brain tissue，Evans blue(EB)content of ischemic hemisphere，the expression of tight junction(TJ)－associated protein occludin and inflammation factor phosphatidylinositiol 3－kinase－p110 gamma(PI3K－p110γ)were tested and analyzed.RESULTS:In IR group，the rats showed elevated neurological function scores(P＜0.01)，brain tissue water content(P＜0.01)and EB content(P＜0.01)，accompanied with the down－regulation of occludin expression(P＜0.01)and up－regulation of PI3K－p110γ(P＜0.01)at 72 h after reperfusion.Compared with IR group，decreased brain edema(P＜0.01)and EB leakage(P＜0.01)were observed in atorvastatin group，accompanied with increased occludin expression(P＜0.01)and decreased PI3K－p110γ expression(P＜0.01).However，no statistical difference of the neurological function scores between the 2 groups was observed.CONCLUSION:Atorvastain attenuates cerebral IR injury，which may be associated with the inhibition of inflammatory reactions and the up－regulation of TJ－associated proteins to maintain the stability of BBB.

Cerebral ischemia－reperfusion;Atorvastatin;Blood brain barrier

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.005

1000－4718(2015)02－219－05

2014－11－07

2014－12－29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30971028);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2012010008539)

△通訊作者Tel:020－87331989;E－mail:hhsums@126.com