邱霓，李聰，方偉進，何玉蓮，韋雪梅，熊燕

(廣州醫(yī)科大學藥學院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 510182)

·論著·

限食8周對大鼠不同類型骨骼肌收縮功能及線粒體生物合成的影響*

邱霓▲，李聰▲，方偉進，何玉蓮，韋雪梅，熊燕△

(廣州醫(yī)科大學藥學院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 510182)

目的:探討限食對不同類型骨骼肌收縮功能和線粒體生物合成的影響，為闡明限食的有益作用及機制提供實驗依據。方法:每天按正常大鼠攝食量的60%飼養(yǎng)動物以制備限食8周大鼠模型，麻醉下分離比目魚肌和趾長伸肌，記錄電刺激誘導骨骼肌單次、強直和疲勞收縮，觀測線粒體基因細胞色素C氧化酶I亞基(COX I)和核基因β－actin拷貝數(shù)的比值以反映線粒體生物合成，檢測骨骼肌ATP含量以反映線粒體功能。結果:限食8周對電刺激誘導的比目魚肌和趾長伸肌的單次和強直收縮均有增強作用，但僅提高比目魚肌的抗疲勞作用;限食也增加兩種肌肉的ATP含量，但對比目魚肌更明顯;限食雖對2種肌肉腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化具有增加作用，但只上調比目魚肌內線粒體生物合成及其調節(jié)基因PGC-1α和NRF的轉錄。結論:限食8周增強大鼠比目魚肌和趾長伸肌對電刺激的收縮反應，尤其對富含氧化型肌纖維的比目魚肌更明顯;其機制除與限食促進這2種肌肉AMPK活化、增加ATP供應以外，還與上調比目魚肌線粒體生物合成及其調控因子有關。

限食;比目魚肌;趾長伸肌;骨骼肌收縮;線粒體生物合成

線粒體能量代謝的調節(jié)功能下降常被作為疾病和衰老的標志。線粒體作為糖脂代謝和機體供能的重要場所，其主要分布在能量需求高的組織中，如骨骼肌、肝臟、心臟、棕色脂肪等。骨骼肌作為維持機體能量代謝平衡的主要器官之一，其收縮功能也依賴于線粒體提供ATP。肌肉質量和收縮能力的漸行性下降是骨骼肌衰老的一個主要特征，骨骼肌內線粒體DNA突變增加、線粒體相關酶活性降低、線粒體含量減少等線粒體功能衰退的表現(xiàn)都是導致骨骼肌衰老的主要原因［1］。

骨骼肌并非由單一肌纖維組成。在小腿骨骼肌中，比目魚肌(soleus，SOL)主要為慢收縮纖維，其富含線粒體和氧化代謝酶，以有氧代謝為主要能量來源;趾長伸肌(extensor digitorum longus，EDL)內富含快收縮纖維，線粒體含量少，主要以糖酵解的方式獲取能量。慢收縮纖維的葡萄糖、脂肪酸攝取率和氧化能力均較快收縮纖維高［2］，有研究證實慢收縮纖維的胰島素誘導葡萄糖攝取率比快收縮纖維要高出近2倍［3］;衰老所致的胰島素抵抗在慢收縮纖維中表現(xiàn)得更加明顯［4］;限食被證實可增加兩類肌纖維的胰島素敏感性，但胰島素誘導的胰島素信號通路蛋白Akt的下游效應分子Akt底物蛋白160(AS160)磷酸化僅在慢收縮纖維中有升高［5］。因此，不同類型骨骼肌除了線粒體含量存在差異外，其代謝特性也有明顯的差別。

適當?shù)南奘?calorie restriction，CR;即在不引起營養(yǎng)不良的情況下，每日僅攝入正常飲食的60%～70%)被證實無論在哺乳動物還是單細胞生物中均可起到延緩衰老，延長壽命的作用［6］，然而其機制尚不明確。限食干預對不同類型骨骼肌的收縮功能和線粒體功能的影響是否一致也尚未見報道。因此，本實驗擬每天給予對照組動物攝食量的60%以制備限食8周大鼠模型，觀測比目魚肌和趾長伸肌收縮功能和線粒體生物合成的變化，比較其影響是否存在差異，并探討存在差異的可能機制，為限食對抗衰老的研究提供新的實驗依據。

材料和方法

1 動物喂養(yǎng)與分組

SPF級雄性SD大鼠40只，體重(200±15)g，購自于廣東省實驗動物中心，動物合格證號為SYXK (粵):2010－0104。所有動物適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為2組，即自由飲食對照(control)組和CR組，每組10只，實驗周期為8周。限食組投食量根據(正常組攝食量/正常組體重×限食組體重×60%)計算，每天分2次投放。

2 實驗方法

2.1 骨骼肌收縮功能測定實驗干預后，腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠，迅速分離左側比目魚肌和趾長伸肌，置于預冷充氧的K－H緩沖液中;將骨骼肌條穿過電極刺激環(huán)的中央，固定于恒溫37℃、持續(xù)充以95%O2和5%CO2混合氣體的KH緩沖液浴槽中，平衡10 min后，調整肌條到最適長度;隨后分別給予單次刺激(10 V電壓、100 ms波寬的脈沖電刺激肌條)、強直刺激［10 V電壓、0.2 ms波寬、60 Hz(比目魚肌)/90 Hz(趾長伸肌)頻率的脈沖電刺激肌條2 s］以及疲勞刺激［10 V電壓，0.5 ms波寬，60 Hz(比目魚肌)/90 Hz(趾長伸肌)頻率的脈沖電刺激肌條，電刺激1 s，休息1 s，依次交替地進行，持續(xù)120 s］，采用Power Lab八道電生理記錄儀和Labchart7數(shù)據采集分析系統(tǒng)控制電刺激強度，并記錄數(shù)據。每次刺激前均需使肌條在恒溫37℃、持續(xù)充以95%O2和5%CO2混合氣體的K－H緩沖液中平衡15 min。

2.2 骨骼肌ATP含量檢測采用熒光素酶法檢測ATP含量，并通過各樣本的蛋白含量進行最終標化。ATP檢測試劑盒和BCA蛋白測定試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司。

2.3 線粒體生物合成測定酚/氯仿法提取比目魚肌和趾長伸肌的基因組DNA，取總DNA 100 ng為模板，加入到20 μL PCR反應體系中，反應條件為94℃3 min;95℃3 min，60℃20 s，72℃30 s，22個循環(huán);72℃7 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進行凝膠圖像分析，以細胞色素C氧化酶I亞基(cytochrome C oxidase subunit I，COX I)與β－actin的比值反映線粒體生物合成情況。引物序列見表1。

2.4 RT－PCR檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator－activated receptor γ coactivator 1α，PGC－1α)和核呼吸因子(nuclear respiratory factor，NRF)mRNA表達Trizol法提取比目魚肌和趾長伸肌的RNA，取總RNA 500 ng為模板，用MMLV cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應合成cDNA。取50 ng cDNA加入到20 μL PCR反應體系中，反應條件為94℃3 min;95℃3 min，58℃20 s，72℃30 s，28個循環(huán);72℃7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后進行凝膠圖像分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of primers for PCR

2.5 Western blotting檢測腺苷酸活化蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)和磷酸化AMPK蛋白的表達取50 mg比目魚肌和趾長伸肌樣本置于500 μL預冷的RIPA裂解液中，冰上電動勻漿20 s，于4℃以12 000×g離心15 min，取上清。采用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS－PAGE，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，分別孵育相應的I抗和II抗，ECL發(fā)光液顯影后，通過ChemiDoxTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用ImageJ軟件進行灰度掃描。其中p－AMPK (Thr172)、AMPK抗體購自Cell Signaling Technology。2.6骨骼肌一氧化氮合酶(NO synthetase，NOS)活性、NO含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定采用比色法檢測NOS活性，采用硝酸還原酶法檢測NO含量，試劑盒購于南京建成生物有限公司。采用WST催化－抑制法檢測總SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，試劑盒購于廣州碧云天生物技術有限公司。各樣本中的蛋白含量通過廣州碧云天生物技術有限公司的BCA蛋白測定試劑盒測定，各指標均需通過各樣本的蛋白含量進行最終標化。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，利用SPSS 11.5和Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析。所有數(shù)據進行正態(tài)性檢驗。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 限食8周對大鼠骨骼肌收縮功能的影響

無論是比目魚肌還是趾長伸肌，限食8周均可導致肌肉重量明顯減少，其中以趾長伸肌重量下降更顯著(P＜0.01)。與對照組相比，限食組比目魚肌和趾長伸肌給予單次刺激和強直刺激后，其收縮能力明顯高于正常對照組(P＜0.05)。疲勞刺激120 s后，比目魚肌的收縮力仍然維持在35%以上，說明其抗疲勞能力明顯強于正常對照組(P＜0.05);而趾長伸肌疲勞刺激120 s后收縮水平將至10%以下，與正常對照組無明顯差別，見圖1。

2 限食8周對大鼠骨骼肌ATP含量的影響

限食8周后大鼠比目魚肌和趾長伸肌內ATP含量均較正常對照組升高約2倍(P＜0.01或P＜0.05)。無論是正常對照組還是限食組，比目魚肌ATP的含量均顯著低于趾長伸肌，見圖2。

3 限食8周對大鼠骨骼肌線粒體生物合成的影響

COX I是調控線粒體氧化磷酸化水平的主要線粒體呼吸鏈酶之一，僅在線粒體中有表達，故線粒體基因COX I和核基因β－actin拷貝數(shù)的比值可一定程度反映線粒體的含量。限食干預后，比目魚肌內COX I/β－actin比值明顯增加(P＜0.01)，而趾長伸肌內COX I/β－actin比值無改變，見圖3。

4 限食8周對骨骼肌線粒體生物合成調節(jié)的影響

限食8周可顯著誘導比目魚肌中調控線粒體功能的PGC－1α及其下游NRF mRNA的表達(P＜0.05);但對趾長伸肌內PGC－1α和NRF mRNA的表達無明顯誘導作用，見圖4。

5 限食8周對骨骼肌AMPK表達的影響

限食8周后，比目魚肌和趾長伸肌中p－AMPK/ AMPK比值均較正常對照組明顯升高(P＜0.01或P＜0.05)，其中以比目魚肌內p－AMPK/AMPK比值升高的幅度更顯著，見圖5。

Figure 1.Calorie restriction for 8 weeks increased the contractility of SOL and EDL.Mean±SD.n=4～5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1 限食8周增加比目魚肌和趾長伸肌收縮功能

Figure 2.Calorie restriction for 8 weeks increased ATP content in SOL(A)and EDL(B).Mean±SD.n=4～5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 限食8周增加比目魚肌和趾長伸肌ATP含量

Figure 3.PCR results of COX I and β－actin DNA contents in SOL(A)and EDL(B)with or without calorie restrction for 8 weeks.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs control.圖3 限食8周增加比目魚肌線粒體生物合成

Figure 4.The results of RT－PCR for mRNA expression of PGC－1α，NRF and GAPDH in SOL(A)and EDL(B)with or without calorie restriction for 8 weeks.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖4 限食8周上調比目魚肌PGC-1α和NRF mRNA表達

Figure 5.The results of Western blotting for p－AMPK and total AMPK protein levels in SOL(A)and EDL(B)with or without calorie restriction for 8 weeks.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖5 限食8周增加比目魚肌和趾長伸肌AMPK蛋白磷酸化

6 限食8周對骨骼肌NOS活性和NO含量的影響

限食8周導致骨骼肌內NOS活性顯著性增加，

伴隨下游NO水平明顯上調(P＜0.05)，見圖6。

Figure 6.The effects of calorie restriction for 8 weeks on NOS activity(A)and NO content(B)in the skeletal muscles.Mean±SD.n=4～5.*P＜0.05 vs control.圖6 限食8周增加骨骼肌內NOS活性及NO含量

7 限食8周對骨骼肌內SOD活性和MDA含量的影響

限食8周可使骨骼肌內SOD的活性明顯增加(P＜0.01)，同時骨骼肌內MDA水平顯著降低(P＜0.05)，見圖7。

Figure 7.The effects of calorie restriction for 8 weeks on SOD activity(A)and MDA content(B)in the skeletal muscles.Mean± SD.n=4～5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖7 限食8周緩解骨骼肌內氧化應激水平

討論

比目魚肌富含氧化型纖維，趾長伸肌富含糖酵解型纖維，因富含的肌纖維類型不同，導致兩種類型的肌肉收縮能力及抗疲勞能力存在差異［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，限食8周可增強比目魚肌和趾長伸肌對于單次刺激和強直刺激所誘導的收縮反應，說明兩種類型的肌肉在瞬間動員ATP的能力上并未存在明顯的差異;但疲勞刺激120 s后，趾長伸肌的收縮力明顯下降，基本低于初始收縮力的10%，而比目魚肌的收縮水平仍維持35%以上，收縮力下降幅度小，表明氧化型纖維經有氧代謝獲取能量，其ATP產生的數(shù)目多，可有效緩解肌肉疲勞。這些結果與不同類型肌纖維的特性相一致，因為氧化型纖維主要以有氧代謝為主要能量來源，可明顯減少乳酸的積聚，從而有效減緩肌肉疲勞，維持運動的持續(xù)性。

限食可通過增加線粒體生物合成，增加線粒體DNA含量、線粒體生物合成調節(jié)基因如PGC-1a、NRF-1、Tfam的表達以及細胞色素C氧化酶的活性，從而緩解因衰老所致的線粒體功能衰退［8］。然而，限食對骨骼肌內線粒體生物合成的影響并不一致。轉錄輔激活因子PGC－1α作為能量代謝網絡的關鍵因子，可與編碼線粒體代謝的眾多基因直接結合，促進線粒體基因的復制和轉錄，調控線粒體的呼吸速率，參與調節(jié)細胞能量代謝［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，限食干預的雄性Wistar大鼠骨骼肌中PGC－1α mRNA和蛋白、線粒體相關基因mRNA、檸檬酸合成酶活性均未發(fā)生明顯地變化［10］;而Miller等［11］在限食雄性B6D2F1小鼠的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)PGC－1α mRNA水平被明顯上調;Hempenstall等［12］也觀察到長期給予30%限食的C57BL/6小鼠腓腸肌內的PGC－1α蛋白以及線粒體相關基因，如PGC－1α、NRF1、COX IV等mRNA水平均明顯增加。本研究結果顯示，限食主要增加比目魚肌中PGC－1α mRNA的表達，導致線粒體呼吸鏈關鍵酶之一COX I基因的表達升高和NRF的轉錄增加;但在趾長伸肌中并未出現(xiàn)此變化。這些結果提示，限食干預后，在能量代謝底物供給不足的情況下，機體為節(jié)約底物的消耗，更加傾向于通過有氧代謝來產生更多的能量，以滿足機體需要，因此比目魚肌細胞內線粒體的氧化代謝能力和生物合成明顯增強;相反，糖酵解為主的趾長伸肌內線粒體的氧化代謝作用則相對降低。

AMPK作為能量的感受器，在維持細胞內能量平衡中起著主要作用。在限食等能量匱乏時，AMP/ ATP比值增加，AMPK被激活，導致分解代謝增加而合成代謝被抑制，葡萄糖轉運、脂肪酸氧化以及線粒體呼吸相關基因的表達上調，脂肪合成相關基因的表達下調，ATP合成增多［13］。研究證實，小鼠骨骼肌特異性表達AMPK無功能基因或敲除AMPK基因，導致其骨骼肌無法在能量被剝奪的情況下做出適應性的改變，線粒體生物合成能力受損，限食誘導的脂肪酸氧化基因無法被激活［14］。另外，AMPK可直接磷酸化PGC－1α，增加PGC－1α的轉錄活性，因此無論在正常生理情況下還是能量需求情況下，AMPK對線粒體功能的調控中均發(fā)揮著重要作用［15－16］。本研究觀察到限食8周可增加比目魚肌和趾長伸肌中p－AMPK/AMPK比值，提示兩種類型的肌纖維在能量代謝底物不足的情況下，均發(fā)生了代償性的變化，以最大限度滿足機體對能量的需求。比目魚肌可能通過增加代謝底物的多樣性，包括增加對脂肪酸氧化，增加線粒體數(shù)目等，達到增加ATP合成的效果;而趾長伸肌由于自身代謝特性，可利用的能量代謝底物較單一，因此僅能通過提高已存在的線粒體氧化代謝效率來增加ATP的合成。

線粒體不僅是產生能量的主要場所，也是細胞內氧自由基的主要來源。當線粒體功能障礙時，氧化應激增加，表現(xiàn)為細胞對氧自由基的清除能力降低，細胞內氧自由基生成增加，導致線粒體呼吸鏈復合物酶活性被抑制，誘導線粒體DNA發(fā)生突變，從而使線粒體出現(xiàn)損傷［17］。MDA是一種脂質過氧化的產物，其含量的增加被認為是自由基與脂質發(fā)生過氧化反應引起細胞膜損傷的結果;而SOD是線粒體重要的抗氧化酶，是清除自由基的重要物質。另外，NO不僅時促進線粒體生物合成的重要因子，也是機體清除自由基的重要物質，其水平也隨著衰老而減少［18－19］;NOS可通過合成NO直接調控PGC-1α的轉錄活性，或者通過AMPK協(xié)同影響PGC-1α的轉錄活性，從而達到調控線粒體生物合成的作用［20］。本研究觀察到限食8周增加骨骼肌NOS活性，升高NO水平，顯著增加SOD活性，明顯降低MDA含量，提示限食可增加骨骼肌對自由基的清除，阻止線粒體膜脂質過氧化，提高骨骼肌線粒體的抗氧化能力，從而減少骨骼肌線粒體的氧化損傷。

本實驗結果表明，限食可增加骨骼肌的收縮能力，改善線粒體功能，但在不同類型骨骼肌中作用有所差異。其中，限食干預可顯著增加比目魚肌的單次、強直收縮和抗疲勞能力，這可能與AMPK活化，上調PGC-1α轉錄活性，增加線粒體生物合成有關;而趾長伸肌經限食干預后雖因可改善其單次、強直收縮能力，但抵抗肌肉疲勞的作用效果不明顯，可能與其線粒體氧化代謝和生物合成能力受限有一定的關系。

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Effects of calorie restriction for 8 weeks on contractile function and mitochondrial biosynthesis in different types of rat skeletal muscles

QIU Ni，LI Cong，F(xiàn)ANG Wei－jin，HE Yu－lian，WEI Xue－mei，XIONG Yan
(Guangzhou Institute of Snake Venom Research and School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China.E-mail:xiongyan2001@yahoo.com)

AIM:To investigate the influence of calorie restriction(CR)on contractility and mitochondrial biosynthesis in different types of rat skeletal muscles.METHODS:CR rat model was set up by feeding 60%normal food intake of control rat every day for 8 weeks.Soleus(SOL)and extensor digitorum longus(EDL)were isolated under anesthesia.The twitch tension，titanic tension and fatigue resistance of SOL and EDL in response to electrical stimulation were measured to reflect the contractile function of the muscles.The copy number ratio of mitochondrial gene cytochrome C oxidase subunit I(COX I)to nuclear gene β－actin was determined to evaluate the mitochondrial biosynthesis.ATP content was measured to mirror mitochondrial function.RESULTS:Compared with control group，CR for 8 weeks significantly increased twitch tension and titanic tension of both SOL and EDL，but only improved fatigue resistance in SOL.Markedly increase in ATP content in both skeletal muscles by CR intervention was observed，especially in SOL.Although CR activated AMP－activated protein kinase(AMPK)in both 2 muscles，up－regulation of mitochondrial biosynthesis and transcription of mitochondrial regulatory genes peroxisome proliferator－activated receptor γ coactivator 1α(PGC-1α)and nuclear respiratory factor(NRF)was only observed in SOL.CONCLUSION:CR for 8 weeks enhanced the contractility of both rat SOL and EDL in response to electrical stimulation，especially in SOL composed of slow－twitch fibers.The mechanisms may be related to the activation of AMPK and the promotion of mitochondrial biosynthesis in SOL.

Calorie restriction;Soleus;Extensor digitorum longus;Skeletal muscle contractility;Mitochondrial biosynthesis

R337;R339.3+8

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.001

1000－4718(2015)02－193－08

2014－08－15

2014－11－06

國家自然科學基金資助項目(No.81170778);廣東省科技計劃(No.2013B021800098);廣州市科技計劃(No.2014J4100067)

△通訊作者Tel:020－81340352;E－mail:xiongyan2001@yahoo.com

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