賴滿香，楊　麗，張榮華△(廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東廣州5050;暨南大學藥學院，廣東廣州5063)

梓醇對OB-OC共育體系中OB、OC活性及OB ERα、β mRNA表達的影響*

賴滿香1，2，楊麗2，張榮華2△
(1廣東食品藥品職業(yè)學院，廣東廣州510520;2暨南大學藥學院，廣東廣州510632)

［摘要］目的:觀察中藥單體梓醇在成骨-破骨共育體系中對成骨細胞( OB)增殖、OB堿性磷酸酶( ALP)活性、破骨細胞( OC)活性及OB雌激素受體( ER)α及β mRNA表達的影響，從細胞水平闡釋其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。方法:分別選取1 d和5 d SD大鼠分離培養(yǎng)OB和OC，并建立OB-OC共育體系;在共育體系中，用MTT法檢測低濃度( 0. 05、0. 1、0. 5、1 mg/L)、中濃度( 2、5、10 mg/L)和高濃度( 20、50和100 mg/L)梓醇干預下的OB增殖率，并以梓醇最佳促OB增殖濃度進行后續(xù)實驗，實驗分為對照組和梓醇組。pNPP法檢測各組OB的ALP活性;光鏡觀察OC骨吸收陷窩數(shù)目;重氮鹽法檢測OC抗酒石酸酸性磷酸酶( TRAP)的活性; RT-PCR方法檢測OB ERα 及ERβ mRNA的表達。結(jié)果:在OB-OC共育體系中，0. 05～2 mg/L梓醇各組中OB的增殖率顯著高于對照組( P＜0. 01)，且0. 05 mg/L梓醇組促進OB增殖的能力明顯高于其它濃度組( P＜0. 01)，5～100 mg/L梓醇各組OB的增殖率與對照組比較無顯著差異( P＞0. 05)。0. 05 mg/L梓醇組的ALP水平高于對照組( P＜0. 05)，并在作用48、72和96 h后均對OC骨吸收陷窩數(shù)及TRAP有明顯抑制作用( P＜0. 01) ; 0. 05 mg/L梓醇組OB中ERα mRNA的表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義( P＞0. 05)，而ERβ mRNA的表達顯著高于對照組( P＜0. 05)。結(jié)論:梓醇在共育體系中可提高OB增殖和成骨活性，抑制OC活性并上調(diào)OB中ERβ mRNA的表達。

［關(guān)鍵詞］梓醇;成骨細胞;破骨細胞;雌激素受體

梓醇屬環(huán)烯醚萜苷類化合物，是地黃的主要有效成分之一［1］。以往藥理研究表明，梓醇能重現(xiàn)地黃抗腫瘤、抗衰老、降血糖等作用［2］。最近有文獻報道［3-4］，梓醇能促進小鼠MC3T3-E1成骨細胞增殖和分化，不同濃度梓醇能促進SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及骨向分化，這與地黃的提取物具有促進成骨細胞( osteoblasts，OB)增殖分化，抑制破骨細胞( osteoclasts，OC)抗酒石酸酸性磷酸酶( tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)活性，降低OC骨吸收陷窩數(shù)量，對骨質(zhì)疏松癥( osteoporosis，OP)有一定的防治作用相一致［5］?？紤]到OP的發(fā)病機制主要是由于OC介導的骨吸收和OB介導的骨形成之間的平衡失調(diào)所致，因此，本實驗在體外建立OB與OC共育體系，觀察中藥單體梓醇在共育體系中對OB增殖、OB堿性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP)活性、OC活性及OB雌激素受體( estrogen receptor，ER)α 及β mRNA表達的影響，為梓醇防治OP的機制研究提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1材料

1.1動物普通級1日齡和5日齡SD新生大鼠，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號為2006B008。

1.2藥物梓醇標準品購買于廣東省藥品檢驗所。1.3主要試劑低糖DMEM培養(yǎng)基( Gibco)，小牛血清( PAA)，0. 25%胰蛋白酶( Amersco)，Ⅱ型膠原酶( Sigma)，RT-PCR檢測試劑盒( TaKaRa)，TRIzol ( Investrigen)，DNA Marker( MBI)。

1.4主要儀器超凈工作臺(蘇州凈化設備廠產(chǎn)品)，倒置相差顯微鏡( Nikon)，CO2培養(yǎng)箱( Thermo)，離心機( Sigma)，細胞培養(yǎng)板( Costar)，酶標儀( Bio-Rad)，紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，PE9600基因擴增儀( PE)，DY-W2型電泳儀(北京生化儀器廠) ; TIGER Gel凝膠分析儀( PE)。

2方法

2.1分離培養(yǎng)OB采用二次酶消化法。取1日齡新生SD大鼠6～10只消毒，取出頭蓋骨，放入盛有D-Hanks緩沖液的培養(yǎng)皿中，剔除附著的結(jié)締組織及骨膜，D-Hanks沖洗3次，至顱骨呈白色。在0. 25%胰蛋白酶消化液內(nèi)將顱蓋骨剪碎，在37℃條件下恒溫消化20 min，以清除纖維組織，棄去消化液。再用0. 1%Ⅱ型膠原酶37℃下消化60 min，不時振蕩，收集上清，1 000 r/min離心10 min，去上清，白色沉淀物即為OB。加入培養(yǎng)液制成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度至1×109/L，將其接種于培養(yǎng)瓶中，放入5% CO2、

37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min后，將培養(yǎng)瓶輕輕傾斜，用吸管吸出培養(yǎng)液至第2瓶培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)10min后，再同樣接種到第3瓶培養(yǎng)瓶中，可得到純度較高的OB。第2天換液，除去未貼壁的細胞。以后每2～3 d換1次液。

2.2分離培養(yǎng)OC采用機械分離法。取5日齡SD大鼠，75%乙醇中浸泡10 min。取出置培養(yǎng)皿中，分離四肢長骨，置于冷D-Hanks緩沖液中。將分離出來的四肢長骨盡量清除骨周軟組織后，立即置于冷DMEM分離液內(nèi)并用解剖刀將骨質(zhì)輕輕快速刮碎，用圓頭滴管反復吹打2 min，使貼附在骨基質(zhì)上的OC脫落下來，直至骨內(nèi)表面變白為止，靜置1 min。懸液用DMEM培養(yǎng)液稀釋到所需密度( 4× 109/L)，按要求接種到有蓋玻片或骨片的培養(yǎng)板孔內(nèi)。置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，吸去培養(yǎng)液，再用預溫的培養(yǎng)液沖掉未貼壁細胞，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)以備活體觀察、細胞染色或用于共育。

2.2.1 兩組治療RAU總有效率的比較 共納入12篇文獻，合計有效率治療組為89.89%（880／979），對照組為 75.13%（580／772），I2＝52%，采用隨機效應模型機型分析，有效率的 RR合并值為1.21，95%CI：1.14～1.29，兩組之間治 RAU總有效率的總效應Z＝6.62，P＜0.001，兩組間差異有統(tǒng)計學意義。見圖1。

2.3OB-OC共育體系的建立對12孔細胞培養(yǎng)板進行改裝，在距培養(yǎng)孔底部2 mm的地方打孔，使相鄰的4孔間相通，中間加1層0. 45 μm的微孔濾膜，膜與培養(yǎng)板接觸處用質(zhì)量分數(shù)3%的瓊脂糖凝膠密封。將制備好的培養(yǎng)板置于紫外線燈下照射消毒，備用。以每孔5×104的密度將OB接種到OB培養(yǎng)室內(nèi)，以每孔5×104的密度將OC接種到OC培養(yǎng)室內(nèi)，每20 min觀察1次OC貼壁情況，同時觀察是否有細胞透過微孔濾膜進入OC培養(yǎng)室。

2.4MTT法測定OB增殖率取培養(yǎng)好的第3代OB以每孔3×104的密度接種于OB培養(yǎng)室，3 h后，將新分離的OC以每孔3×104接種于OC培養(yǎng)室; 24 h后換入無血清培養(yǎng)液，待細胞周期同步化24 h后，更換為不同濃度的梓醇培養(yǎng)液。各劑量組的終濃度分別為低濃度組( 0. 05、0. 1、0. 5和1 mg/L)、中濃度組( 2、5和10 mg/L)和高濃度組( 20、50和100 mg/ L)。每個濃度設6個復孔。僅加DMEM完全培養(yǎng)液為空白對照組。分別培養(yǎng)7 d，棄去培養(yǎng)液，DHanks液沖洗3次，更換無血清的DMEM培養(yǎng)基400 μL，同時每孔加入5 g/L的MTT 80 μL，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，在酶標儀上測吸光度( A)，波長為570 nm。參比波長為630 nm。通過實驗結(jié)果確定梓醇的敏感藥物濃度。

2.5實驗分組及處理取第3代OB以每孔5×104的密度接種于OB培養(yǎng)室，3h后，將新分離的OC以每孔5×104接種于OC培養(yǎng)室;待細胞周期同步化24 h后，將實驗分為對照組和梓醇組，其中對照組僅加DMEM完全培養(yǎng)液，梓醇組加入敏感藥物濃度梓醇。

2.6pNPP法檢測OB ALP活性各組加入相應藥物7 d后，棄去培養(yǎng)液，D-Hanks液沖洗3次，每孔加入500 μL 0. 1% Triton X-100作用30 min，收集細胞裂解液，采用ALP試劑盒檢測其活性。用金氏單位( 100 mL血清在37℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位)表示，具體操作按試劑盒說明。2.7光鏡觀察OC骨吸收陷窩數(shù)取第3代OB以每孔5×104的密度接種于OB培養(yǎng)室，3 h后，將新分離的OC以每孔5×104接種于OC培養(yǎng)室;待細胞周期同步化后，在已放入象牙薄片的OC室再分別加入敏感藥物濃度0. 05 mg/L的梓醇組及對照組，2～3 d換液1次。分別培養(yǎng)24、48和72 h，取出所有象牙薄片，在2. 5%戊二醛固定液中于4℃固定7 min，然后在0. 25% NH3·H2O溶液中超聲清洗1 min，共3次，經(jīng)系列乙醇脫水，自然晾干后，置甲苯胺藍染液中，室溫下染色3～4 min，蒸餾水清洗后于光鏡下對整張象牙薄片上的吸收陷窩進行拍照和計數(shù)。

2.8重氮鹽法檢測OC TRAP活性各組加入相應藥物后分別培養(yǎng)24、48和72 h，收集各組OC培養(yǎng)室上清液，按試劑盒說明進行TRAP活性的檢測。

2.9RT-PCR檢測OB中ERα/β mRNA的表達各組加入相應藥物進行培養(yǎng)，當細胞鋪滿培養(yǎng)板的底面時，棄去培養(yǎng)液，D-Hanks液沖洗3次，用0. 25%的胰蛋白酶將各孔中的OB消化下來，每孔加入1 mL TRIzol裂解細胞，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取總RNA。cDNA的合成采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應體系: 總RNA 2 μL、Oligo 2 μL、dNTP 2 μL、RNase-free ddH2O 7. 5 μL置PCR儀上70℃5 min，后立即于4℃冰浴3 min，再依次加入5×Buffer 4 μL、RNasin 0. 5 μL、0. 1 mol/L DTT 1 μL、RIAScript M-MLV 1 μL 置PCR儀上42℃反應50 min，90℃加熱5 min終止反應，所得cDNA在－20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應總體系( 20 μL) : cDNA 2 μL、上游引物( 50 μmol/L) 1 μL、下游引物( 50 μmol/L) 1 μL、dNTPs ( 10 mmol/ L) 2 μL、10×PCR Bμffer 2. 5 μL、Taq酶( 5 U/μL) 0. 5 μL、ddH2O 11 μL，PCR程序: ERα和ERβ擴增溫度參數(shù): 95℃，3 min; 95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，擴增35個循環(huán);末次循環(huán)72℃5 min，4℃終止;β-actin擴增溫度參數(shù):預變性95℃，3 min; 95℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，擴增35個循環(huán);末次循環(huán)72℃5 min，4℃終止。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，用凝膠圖像分析儀照相，BANDSCAN圖像分析軟件進行灰度半定量分析。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件處理，多組間比較運用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差( mean±SD)表示。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1共育體系中OB的形態(tài)

2共育體系中OC的形態(tài)

HE染色可見細胞呈油煎蛋形、長條形、漏斗形或不規(guī)則形等多種形態(tài);胞體大，多核，一般為3～4個，染為藍紫色;胞質(zhì)少，染為淡紅色，或無色，見圖1B。這說明所培養(yǎng)細胞的形態(tài)符合OC形態(tài)。

Figure 1.Morphology of OB and OC.A: OB 2 d after inoculation (×100) ; B: HE staining of OC (×400).圖1　OB和OC的形態(tài)

3梓醇對OB增殖的影響

在OB-OC共育體系中，各個濃度的梓醇對OB干預后，其A值均高于對照組，其中低濃度( 0. 05、0. 1、0. 5和1 mg/L)梓醇組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義( P＜0. 01)，組內(nèi)各濃度通過兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義;中濃度( 2、5和10 mg/L)梓醇組與對照組比較，其中2 mg/L差異有統(tǒng)計學意義，而5和10 mg/L差異沒有統(tǒng)計學意義，組內(nèi)各濃度通過兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義;高濃度的梓醇組( 20、50、100 mg/L)與對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1　不同濃度梓醇對OB增殖的影響Table 1.Effect of different concentrations of catalpol on OB proliferation ( Mean±SD.n =6)

4梓醇對OB ALP活性的影響

在共育體系中，梓醇組OB的ALP活性顯著高于對照組( P＜0. 01)，見表2。

表2　梓醇對OB ALP活性的影響Table 2.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on ALP activity of OB( King unit.Mean±SD.n =6)

5梓醇對OC骨吸收陷窩的影響

在共育體系中，倒置顯微鏡下觀察，可見象牙薄片上有大小不等的橢圓形、圓形、或不規(guī)則型的藍紫色骨吸收陷窩，邊界清晰。梓醇組骨吸收陷窩數(shù)明顯低于對照組( P＜0. 01)，見表3。

表3　梓醇對OC骨吸收陷窩的影響Table 3.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on bone resorption pitsof OC ( Mean±SD.n =6)

6梓醇對OC TRAP活性的影響

TRAP活性隨著培養(yǎng)時間的延長呈下降趨勢，且梓醇組在作用48、72和96 h后，OC的TRAP活性均顯著低于對照組( P＜0. 05)，見表4。

表4　梓醇對OC TRAP活性的影響Table 4.Effect of catalpol ( 0. 05 mg/L) on TRAP activity of OC ( U/L.Mean±SD.n =6)

7梓醇對OB ERα/β mRNA表達的影響

梓醇組和對照組經(jīng)RT-PCR擴增后，均有目的基因ERα和ERβ的條帶，片段大小和預期產(chǎn)物相近;對照組ERα mRNA與梓醇組的目的基因無明顯差別，而對照組ERβ mRNA表達較梓醇組弱，見圖2。經(jīng)半定量分析，對照組的ERα mRNA的表達與梓醇組比較無顯著差別( P＞0. 05)，而梓醇組ERβ mRNA的表達顯著高于對照組( P＜0. 01)，見表5。這說明梓醇在共育體系中可以上調(diào)OB中ERβ mRNA表達，而對ERα mRNA的作用不顯著。

Figure 2.Effect of catalpol on the expression of ERα/β mRNA.M: marker; 1，3，5，7:β-actin; 2，4: ERα; 6，8: ERβ; 1，2，5，6: catalpol group; 3，4，7，8: control group.圖2　梓醇對OB ER α、βmRNA表達的影響

表5　各組灰度半定量比值Table 5.Gray semi-quantitative ratio of different groups ( Mean ±SD.n =6)

討論

在正常生理條件下，骨組織中OB與OC間的功能活動并不是相互孤立存在的，骨組織的代謝依賴這兩種細胞相互作用; OB介導的骨形成與OC介導的骨吸收相互偶聯(lián)，使骨重建處于一種動態(tài)平衡中，從而維持機體骨量與骨密度的正常［6］。在骨重建過程中，OB與OC間的功能存在直接或間接的信號交流，其中OPG/RANKL/RANK軸對破骨細胞分化、成熟及骨吸收功能發(fā)揮著重要作用，是OB和OC之間信號交談的重要轉(zhuǎn)導通路［7］。在骨重建逆轉(zhuǎn)過程中，即骨吸收向骨形成轉(zhuǎn)化過程中，OC分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長因子等是OB活化的關(guān)鍵［8］。本實驗重視OB和OC兩者之間的相互作用，采用平面式OB-OC共育模型，能在倒置顯微鏡下觀察2種細胞的情況，可同時收集兩室的細胞進行定量學指標的檢測;中間隔膜的孔徑為0. 45 μm，蛋白質(zhì)可以自由通過，而OB和OC因直徑在30 μm以上，不能越過隔膜，這種細胞間液可以相互交流但細胞互不接觸的共育模型具有實際意義。

OB的增殖率能直接反映OB的生長情況，是促骨形成藥物藥效評價的基本指標。實驗結(jié)果表明:與對照組相比，梓醇干預后OB的增殖率明顯升高，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，其中0. 05～2 mg/L的梓醇組作用顯著，且以0. 05 mg/L梓醇組中的A值明顯高于其它濃度組，說明0. 05 mg/L梓醇OB增殖的能力明顯高于其它濃度組，5～100 mg/L的梓醇對OB增殖也無明顯作用，提示隨著梓醇濃度的升高，梓醇促進OB的增殖的能力下降，推測低濃度的梓醇對OP患者OB數(shù)量下降可能具有一定的改善作用。ALP是一種普遍存在的細胞內(nèi)酶。在骨代謝異常和骨病中ALP活性可作為OB功能及分化的指標之一。ALP在細胞中的表達多少，可反映出OB的分化程度和功能狀態(tài)，ALP活性越高，說明前成骨細胞向成熟的OB分化得越明顯［9］。實驗結(jié)果顯示梓醇組中OB的ALP活性與對照組相比有顯著的統(tǒng)計學意義，說明梓醇能夠提高OB ALP的活性，促進OB的分化。實驗結(jié)果與Oh等［5］報道的地黃提取物能提高OB的增殖及OB中ALP的活性相一致。提示梓醇可能是地黃防治OP的有效成分之一。

骨吸收陷窩是OC骨吸收的直接結(jié)果，其陷窩數(shù)量、大小和深度直接反映了OC的骨吸收能力［10］。因此觀察骨吸收陷窩的形態(tài)和測量陷窩的數(shù)量、大小是檢測OC骨吸收功能的可靠指標。本實驗結(jié)果顯示，在OB-OC共育體系中不同濃度的梓醇對OC骨吸收陷窩形成數(shù)目明顯低于對照組。說明梓醇對OC活性有直接的抑制作用。TRAP是OC釋放入循環(huán)系統(tǒng)，直接參與OC骨吸收過程中的一種溶酶體，其可以降解骨內(nèi)固體鈣磷礦化物，TRAP的出現(xiàn)標志著OC的形成和OC活動的開始，并在一定程度上反映了骨吸收狀況［11-12］。本實驗結(jié)果表明，在OB-OC共育體系中，隨著培養(yǎng)時間的延長，梓醇組和對照組TRAP活性都有所降低，提示隨著培養(yǎng)時間延長，OC分泌TRAP的數(shù)量和活性在下降;但在同一時段，梓醇組TRAP活性都明顯低于對照組，說明梓醇具有抑制OC分泌TRAP的能力。

梓醇是一種環(huán)烯萜類物，是從地黃中提取出來的主要有效成分之一。曲有樂等［13］采用體內(nèi)動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，熟地黃能顯著對抗老年進程中OB孕激素受體的下降，從而對抗OP的發(fā)生，說明地黃中的某種成分具有類雌激素的作用。本實驗通過RTPCR的方法發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的OB在功能表達過程中均能檢測到ERα mRNA和ERβ mRNA的RT-PCR的產(chǎn)物，且ERβ mRNA的表達要高于ERα mRNA，加入梓醇后，OB中ERβ mRNA的表達水平均顯著提高，與對照組相比有統(tǒng)計學意義，而ERα mRNA表達無明顯差異，提示梓醇能夠上調(diào)ERβ mRNA的表達，其原因可能與ERβ mRNA在OB中的表達高于ERα mRNA有關(guān)，這與雌激素對骨形成的作用主要是由ERβ調(diào)控的觀點相一致［14］。本實驗提示梓醇可能具有類雌激素樣作用，對此，還有待進一步研究證實。

綜上所述，我們認為梓醇在OB-OC共育體系中能夠刺激OB的增殖、提高OB ALP活性，并同時抑制OC活性，上調(diào)OB ERβ mRNA的表達水平。梓醇可能是地黃防治OP的有效成分之一。

［參考文獻］

［1］劉衛(wèi)欣，盧兗偉，杜海濤，等.地黃及其活性成分藥理作用研究進展［J］.國際藥學研究雜志，2009，36( 4) : 277-280.

［2］楊洪楓，李愛峰，張永清.地黃中梓醇的研究進展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，5( 8) : 209-210.

［3］武密山，趙素芝，李恩，等.地黃活性成分梓醇對小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖、分化和礦化的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26( 4) : 509-513.

［4］傅淑平，張榮華.不同濃度梓醇對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及骨向分化的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，10( 23) : 2398-2400.

［5］Oh KO，Kim JY，Ko SY，et al.Effect of Rehmannia glutinosa Libosch extracts on bone metabolism［J］.Clin Chim Acta，2003，334( 1-2) : 185-195.

［6］廖乃順，陳文列，黃云梅，等.成骨細胞與破骨細胞共培養(yǎng)及其應用研究進展［J］.中國骨傷，2013，4( 26) : 349-352.

［7］Odkhuu E，Koide N，Haque A，et al.Inhibition of receptor activator of nuclear factor κB ligand ( RANKL) -induced osteoclast formation by pyrroloquinoline quinine ( PQQ)［J］.Immunol Lett，2012，142( 1-2) : 34-40.

［8］Matsuo K，Irie N.Osteoclast-osteoblast communication ［J］.Arch Biochem Biophys，2008，473( 2) : 201-209.

［9］傅淑平，張榮華，徐立群.益骨膠囊含藥血清在共育體系中對大鼠成骨細胞增殖、ALP活性及IL-11 mRNA表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2006，22( 6) : 1171-1173.

［10］張榮華，徐立群，傅淑平，等.益骨膠囊含藥血清對共育體系中破骨細胞活性和凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2006，22( 5) : 1001-1004.

［11］Aubin JE.Advances in the osteoblast lineage［J］.Biochem Cell Biol，1998，76( 6) : 899-910.

［12］Chen X，Anderson JJB.Isoflavones and bone: animal and human evidence of efficiency［J］.J Musculoskelet Neuronal Interact，2002，2( 4) : 352-359.

［13］曲有樂，陳虹，龐茂征.熟地黃提取液對小鼠Na+、K+-ATPase活性影響的研究［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2001，18( 3) : 194-195.

［14］原春玲，歐陽玲莉.雌激素α受體、β受體與骨代謝研究進展［J］.中國醫(yī)學文摘:內(nèi)科學，2005，26( 6) : 751-754.

Effect of catalpol on activity of osteoblasts/osteoclasts and osteoblast ERα/β mRNA expression in osteoblast-osteoclast co-culture system

LAI Man-xiang1，2，YANG Li2，ZHANG Rong-hua2
(1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China;2Pharmacy College of Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail: tzrh@ jnu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of catalpol on the activity of osteoblasts ( OB) and osteoclasts ( OC)，and OB estrogen receptor ( ER)α/β mRNA expression in the OB-OC co-culture system.METHODS: OB and OC were isolated from the SD rats of 1 and 5 days old.In the OB-OC co-culture system，different concentrations of catalpol including low dosage ( 0. 05，0. 1，0. 5 and 1 mg/L)，middle dosage ( 2，5 and 10 mg/L)，and high dosage ( 20，50 and 100 mg/L) were added into the culture medium to detect the changes of OB proliferation by MTT assay.The catalpol at maximal dosage was added to OB section to detect the alkaline phosphatase ( ALP) activity of OB by pNPP method.The mRNA expression of ERα/β in the OB treated with catalpol in the co-culture system was detected by RT-PCR.The catalpol at maximal dosage was added to OC group to detect the activity of OC by microscopy and tartrate-resistantacid phosphatase ( TRAP) activity detection.RESULTS: In 0. 05～2 mg/L catalpol groups，the proliferation of OB was significantly increased as compared with control group in the co-culture system，and it reached the maximum value when catalpol was at 0. 05 mg/L，while in 5～100 mg/L catalpol groups，the proliferation of OB was not increased.The ALP activity of OB in 0. 05 mg/L catalpol group was higher than that in control group.The catalpal at 0. 05 mg/L promoted the mRNA expression of ERβ in OB in the co-culture system，but did not increase the mRNA expression of ERα as compared with control group.Catalpol at 0. 05 mg/L obviously inhibited the bone resorption and the TRAP activity in OC.CONCLUSION: Catalpol stimulates the proliferation and activity of OB，inhibits the bone resorption and activity of OC，and increases the mRNA expression of ERβ in OB in the OB-OC co-culture system，suggesting that high mRNA expression of ERβ may be the regulatory pathway of catalpol in response to bone metabolism.

［KEY WORDS］Catalpols; Osteoblasts; Osteoclasts; Estrogen receptors

通訊作者△Tel: 020-85220023; E-mail: tzrh@ jnu.edu.cn

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目( No.81473509; No.81173619)

［收稿日期］2015-01-07［修回日期］2015-03-27

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1242-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.016