劉　華，陳　昊，唐　照，張葉敏，李明欣，汪長華△(連云港市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇連云港00;武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北武漢43007)

全反式維甲酸通過DOK1/PPARγ信號通路抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖*

劉華1，陳昊1，唐照2，張葉敏2，李明欣2，汪長華2△
(1連云港市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇連云港222002;2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北武漢430071)

［摘要］目的:探討全反式維甲酸( ATRA)對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響及可能機(jī)制。方法: MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，蛋白免疫印跡檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)，MTT法和溴脫氧尿嘧啶核苷( BrdU)摻入法測定細(xì)胞增殖，TUNEL法測定細(xì)胞凋亡，攜帶目標(biāo)基因shRNA的慢病毒用于沉默目標(biāo)基因，過氧化物酶體增殖物激活受體γ( PPARγ)的活性采用商品化的試劑盒測定。結(jié)果: ATRA處理可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡;同時，ATRA以時間依賴方式刺激?？康鞍?( DOK1)的表達(dá)。沉默DOK1可降低ATRA對MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響。此外，DOK1基因沉默可抑制PPARγ的表達(dá)和活性。而PPARγ選擇性抑制劑GW9662可減輕ATRA對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制和對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。結(jié)論: ATRA通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制MCF-7細(xì)胞的生存，這一作用經(jīng)DOK1激活的PPARγ介導(dǎo)。

［關(guān)鍵詞］全反式維甲酸;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;?？康鞍?; MCF-7細(xì)胞

全反式維甲酸( all-trans retinoic acid，ATRA)是一種具有廣泛生物學(xué)活性、存在于生命體內(nèi)的維生素A代謝中間產(chǎn)物，其抗腫瘤作用已在基礎(chǔ)和臨床領(lǐng)域得到了廣泛的研究。因其具有抑制腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)免疫系統(tǒng)抗腫瘤作用、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療治療敏感性等特性，ATRA已被用于某些腫瘤，如急性早幼粒細(xì)胞白血病等的臨床治療［1-2］。近年研究表明，ATRA也有可能用于各種形式乳腺癌的治療［3］。但迄今為止，ATRA抗乳腺腫瘤的作用機(jī)制仍有待深一步的研究。

?？康鞍? docking protein，DOK)家族包括DOK1～DOK7，在腫瘤發(fā)生、胰島素抵抗、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用［4-6］。其中，DOK1～DOK6的mRNA已被證實(shí)表達(dá)在正常乳腺組織和乳腺癌組織中［7］。我們早期的研究表明，分子量為62 kD的DOK1蛋白可與p120-RasGAP結(jié)合，從而抑制Ras-Raf-MEK-ERK信號通路［8］。由于這一特性，DOK1被認(rèn)為是體內(nèi)主要的抑癌基因之一［5-6］。這一結(jié)論也已得到在體研究結(jié)果的證實(shí)，缺乏DOK1、DOK2和DOK3的小鼠易于患惡性腫瘤［4］，而DOK2 和DOK6表達(dá)水平的降低與乳腺癌進(jìn)展密切相關(guān)［7］。但有關(guān)DOK1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及治療中的作用并未見太多報道。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATRA可通過增加DOK1的表達(dá)激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ( peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)，由此起到抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用。

材料和方法

1材料與試劑

ATRA、MTT和抗tubulin抗體購于Sigma; caspase-3抗體和PPARγ抗體購于CST;抗DOK1抗體和抗堿性磷酸酶標(biāo)記的II抗購自Santa Cruz;溴脫氧尿嘧啶核苷( bromodeoxyuridine，BrdU)細(xì)胞增殖ELISA試劑盒購自Abcam; DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清( fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞購自ATCC，常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素( penicillin/streptomycin，P/S)的DMEM中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。攜帶人DOK1-shRNA和對照序列的慢病毒購于Santa Cruz。MCF-7細(xì)胞的病毒感染按該公司質(zhì)粒感染說明書進(jìn)行。

2.2細(xì)胞增殖測定細(xì)胞增殖分別采用MTT法和BrdU摻入法測定。MTT法如下: 96孔板每孔種植1 ×103細(xì)胞，培養(yǎng)于100 μL含2% FBS的DMEM中。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，加入150 μL新鮮無酚紅培養(yǎng)液，50 μL濃度為0. 5 g/L的MTT，37℃培養(yǎng)3 h。其后，小心去除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL MTT溶劑。培養(yǎng)板用錫紙避光，置于軌道搖床混合15 min，590 nm讀取吸光度( A)。BrdU摻入法按試劑盒說明書測定。

2.3Western blot蛋白的提取與定量按本實(shí)驗(yàn)室以前報告的方法進(jìn)行［9］。蛋白定量后的細(xì)胞裂解液與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸變性蛋白，14 000×g離心10 min，取上清行SDSPAGE。蛋白免疫印跡的基本流程如下:恒壓100 V電泳，恒壓100 V、140 min、4℃電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，1%牛血清白蛋白封阻1 h，I抗4°C孵育過夜，II抗室溫孵育1 h，NBT/BCIP堿性磷酸酶顯色試劑顯色，Image-Pro Plus軟件分析結(jié)果。

2.4細(xì)胞凋亡測定細(xì)胞凋亡采用TUNEL法測定，試劑盒購于Roche，具體操作按說明書進(jìn)行。凋亡細(xì)胞利用Olympus FluoView FV1000共聚焦顯微鏡觀察。為計算凋亡率，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每次隨機(jī)取5個玻片，每個玻片隨機(jī)取6個視野，計數(shù)總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)。

2.5PPARγ活性測定PPARγ轉(zhuǎn)錄因子檢測試劑盒購于Abcam，按試劑盒說明書測定。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上，并具有相似結(jié)果。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示。計量資料組間比較采用Student’s t檢驗(yàn)或單因素方差分析，計數(shù)數(shù)據(jù)按χ2檢驗(yàn)。以P＜0. 05為有差異統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 ATRA抑制MCF-7細(xì)胞生存

為觀察ATRA對細(xì)胞增殖的影響，MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含2% FBS、1% P/S的培養(yǎng)液中，同時接受1 mg/L的ATRA和同劑量對照溶劑處理5 d，MTT法和BrdU摻入法分別測定細(xì)胞活性與增殖。ATRA明顯降低MTT吸光度;同時，ATRA也明顯降低BrdU的摻入，表明ATRA可抑制細(xì)胞增殖。為探討ATRA對細(xì)胞凋亡的影響，MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含1% FBS、1% P/S和1 mg/L ATRA的DMEM中72 h，同劑量的溶劑為對照，TUNEL測定細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATRA組27. 1%的細(xì)胞呈現(xiàn)為凋亡陽性，而對照組凋亡陽性細(xì)胞只占3. 5%，兩組比較差異顯著( P＜0. 01)。與此結(jié)果相一致，ATRA處理明顯增加了活化型凋亡蛋白酶3( cleaved caspase-3)的蛋白水平。這些結(jié)果提示ATRA可通過抑制增殖、促進(jìn)凋亡而抑制細(xì)胞生存，見圖1。

Figure 1.All-trans retinoic acid ( ATRA) suppressed proliferation and enhanced apoptosis of MCF-7 cells.Mean±SD.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group.圖1　全反式維甲酸抑制MCF-7細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

2 ATRA增加DOK1的表達(dá)

為觀察ATRA對DOK1蛋白表達(dá)的影響，MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1% P/S的培養(yǎng)液中，同時分別接受1 mg/L的ATRA處理12 h、24 h、48 h和72 h。Western blot檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATRA以時間依賴方式增加DOK1表達(dá)。半定量分析結(jié)果表明，ATRA處理24 h以上可顯著增加DOK1含量，見圖2。

3 DOK1介導(dǎo)ATRA對MCF-7細(xì)胞生存的抑制作用

為闡明DOK1在ATRA抑制MCF-7細(xì)胞生存中的作用，我們利用攜帶DOK1-shRNA的慢病毒敲除DOK1的表達(dá)，其相應(yīng)的攜帶scramble序列的慢病毒作為對照。DOK1-shRNA明顯降低DOK1的表達(dá)。經(jīng)攜帶DOK1-shRNA或scramble序列病毒處理的MCF-7細(xì)胞按前述方法分別檢測細(xì)胞增殖和凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOK1-shRNA處理可提高細(xì)胞活性，增強(qiáng)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡;同時降低了cleaved caspase-3的蛋白水平。這些結(jié)果提示DOK1介導(dǎo)了ATRA對MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用，見圖3。

Figure 2.All-trans retinoic acid ( ATRA) elevated DOK1 expression in MCF-7 cells.Mean±SD.n = 4.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group.圖2　全反式維甲酸增加MCF-7細(xì)胞DOK1蛋白表達(dá)

4 沉默DOK1可抑制PPARγ的表達(dá)和活性為闡明PPARγ與DOK1間的關(guān)系，我們利用蛋白免疫印跡檢測DOK1沉默或?qū)φ占?xì)胞中PPARγ的表達(dá)和磷酸化，采用PPARγ轉(zhuǎn)錄因子測定試劑盒測定PPARγ活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOK1沉默細(xì)胞呈現(xiàn)出低的PPARγ蛋白表達(dá)、高的第112位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化以及降低的PPARγ轉(zhuǎn)錄活性，表明DOK1對PPARγ具有正向調(diào)節(jié)作用，見圖4。

Figure 3.Silence of DOK1 attenuated the anti-cancer effect of all-trans retinoic acid ( ATRA) in MCF-7 cells.Mean±SD.n = 6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ATRA-treated scramble cells.圖3　沉默DOK1降低全反式維甲酸的抗腫瘤效應(yīng)

5 PPARγ介導(dǎo)ATRA對MCF-7細(xì)胞生存的抑制作用

為探討PPARγ是否介導(dǎo)ATRA對MCF-7細(xì)胞生存的抑制作用，MCF-7細(xì)胞在接受ATRA處理的同時，接受10 μmol/L PPARγ選擇性抑制劑GW9662的處理，按前述方法分別檢測細(xì)胞增殖和凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn): GW9662處理可提高細(xì)胞活性，增強(qiáng)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，同時降低了cleaved caspase-3的蛋白水平，見圖5。這些結(jié)果提示: PPARγ在ATRA 對MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)中具有重要作用。

Figure 4.DOK1 regulated PPARγ expression and activity in MCF-7 cells.Mean±SD.n = 4.*P＜0. 05 vs scramble.圖4　DOK1蛋白調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)和活性

討論

一般認(rèn)為，ATRA通過其核受體而發(fā)揮作用，包括視黃酸受體( retinoic acid receptor，RAR)和維甲酸X受體( retinoid X receptor，RXR)，ATRA與受體結(jié)合將激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其功能［1-2］。此外，研究表明其它信號通路也可介導(dǎo)ATRA的抗腫瘤作用，如PI3K/AKT和ERK通路［10］、mTOR信號通路［11］、Wnt/β-catenin信號通路［12］等。本研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡，并伴隨有DOK1蛋白的表達(dá)增加;沉默DOK1可降低PPARγ的表達(dá)和活性;沉默DOK1基因或利用PPARγ選擇性抑制劑均可逆轉(zhuǎn)ATRA對MCF-7細(xì)胞生存的影響。這些結(jié)果證實(shí)ATRA抗乳腺癌細(xì)胞生長的作用可經(jīng)DOK1/PPARγ信號通路介導(dǎo)，為ATRA抗腫瘤作用提供了新的機(jī)制。

Figure 5.Inhibition of PPARγ attenuated the anti-cancer effect of all-trans retinoic acid ( ATRA) in MCF-7 cells.Mean±SD.n =6.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ATRA group.圖5　抑制PPARγ降低全反式維甲酸的抗腫瘤效應(yīng)

DOK1屬于腫瘤抑制基因，其高表達(dá)可抑制腫瘤生長。在白血病HL-60細(xì)胞中，ATRA可促進(jìn)DOK1的表達(dá)，并由此調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化［13］。我們的結(jié)果與其一致，ATRA同樣可以增加乳腺癌MCF-7細(xì)胞DOK1的表達(dá)，起到抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的作用。而且，我們還發(fā)現(xiàn)，DOK1通過調(diào)節(jié)PPARγ而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。

PPARγ屬于激素核受體超家族成員，具有調(diào)節(jié)葡萄糖與脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長與分化等作用，在胰島素抵抗、肥胖、糖尿病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。新近研究表明: PPARγ表達(dá)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中。盡管PPARγ腫瘤抑制作用的機(jī)理并不清楚，大量證據(jù)表明PPARγ激動劑可通過激活PPARγ，有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長停滯、凋亡以及分化，為腫瘤的治療提供一個新的靶點(diǎn)［14］。本研究的結(jié)果表明，DOK1的高表達(dá)可激活PPARγ，而PPARγ抑制劑可逆轉(zhuǎn)ATRA的抗腫瘤作用，表明PPARγ介導(dǎo)了ATRA的作用。

需要回答的問題是DOK1如何激活PPARγ。DOK1的主要功能是通過與p120-RasGAP蛋白的結(jié)合抑制PI3K/AKT和Ras-Raf-MEK-ERK信號通路［8］。研究表明，ERK信號通路與PPARγ具有廣泛的聯(lián)系，可相互影響，其具體的作用形式和方法依賴于細(xì)胞的類型。在缺乏DOK1的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞( MEF細(xì)胞)中，ERK的活性和PPARγ在Ser112位點(diǎn)的磷酸化均明顯增加;相反，恢復(fù)DOK1的表達(dá)可導(dǎo)致ERK活性和PPARγ在Ser112位點(diǎn)磷酸化的降低;而且DOK1對PPARγ在Ser112位點(diǎn)磷酸化的影響可被ERK特異性抑制劑逆轉(zhuǎn)［15］。由于PPARγ 在Ser112位點(diǎn)磷酸化的程度與其活性呈相反關(guān)系，即該位點(diǎn)磷酸化的增加表明其活性降低，因此，DOK1的缺乏將降低PPARγ的活性［15］。這一結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全一致，沉默DOK1的MCF-7細(xì)胞可導(dǎo)致PPARγ蛋白含量的降低、PPARγ在Ser112位點(diǎn)的磷酸化增加以及PPARγ轉(zhuǎn)錄活性的降低(圖4)。因此，DOK1可通過對ERK的抑制作用，降低PPARγ在Ser112位點(diǎn)磷酸化，提高PPARγ的活性，并借此影響腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。

總之，本研究結(jié)果表明，ATRA通過誘導(dǎo)DOK1表達(dá)，并由此增強(qiáng)PPARγ活性而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，該研究結(jié)果加深了對ATRA治療乳腺癌作用機(jī)理的認(rèn)識，為其抗乳腺癌治療提供了新的理論解釋。

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All-trans retinoic acid suppresses proliferation of breast cancer cells through DOK1/PPARγ pathway

LIU Hua1，CHEN Hao1，TANG Zhao2，ZHANG Ye-min2，LI Ming-xin2，WANG Changhua2
(1Department of Pathology，The First People’s Hospital of Lianyungang，Lianyungang 222002，China;2Department of Pathophysiology，Wuhan University School of Basic Medical Sciences，Wuhan 430071，China.E-mail: chwang0525@ whu.edu.cn)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the potential effect of all-trans retinoic acid ( ATRA) on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and its underlying mechanism.METHODS: Human breast cancer MCF-7 cells were incubated in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin.Western blot was performed to detect the protein expression and its phosphorylation.MTT assay and bromodeoxyuridine ( BrdU) incorporation，and TUNEL staining were carried out to determine the cell proliferation and apoptosis，respectively.Lentivirus carrying shRNA sequences targeting the gene of docking protein 1 ( DOK1) was used to silence DOK1 expression.The activity of peroxisome proliferator-activated receptor gamma ( PPARγ) was measured using a PPARγ transcription factor assay kit.RESULTS: ATRA treatment suppressed the proliferation and promoted the apoptosis of MCF-7 cells.ATRA was also found to induce DOK1 expression in a time-dependent manner.Silence of DOK1 mitigated anti-cancer effect of ATRA evidenced by recovered the cell proliferation and reduced the cell apoptosis.In addition，DOK1 knockdown inhibited PPARγ expression and activity.Furthermore，inhibition of PPARγ with its specific inhibitor GW9662 attenuated impacts of ATRA on the cell proliferation and apoptosis.CONCLUSION: ATRA suppresses MCF-7 cell survival through inhibiting cell proliferation and promoting cell apoptosis，which is mediated by DOK1-activated PPARγ.

［KEY WORDS］All-trans retinoic acid; Cell proliferation; Apoptosis; Docking protein 1; MCF-7 cells

通訊作者△Tel: 027-68759846; E-mail: chwang0525@ whu.edu.cn

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.30770758/H0178)

［收稿日期］2015-01-08［修回日期］2015-03-20

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1178-06

［中圖分類號］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.005