趙蘭平，　薛淑芳，　陳彥靜，王雪芳，　陳立鋒(河北北方學院生理教研室，河北張家口075000;中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京00700)

一氧化氮對缺血再灌注豚鼠左心室流出道自律性電活動的影響*

趙蘭平1△，薛淑芳1，陳彥靜2，王雪芳1，陳立鋒1
(1河北北方學院生理教研室，河北張家口075000;2中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京100700)

［摘要］目的:研究一氧化氮( NO)對豚鼠左心室流出道自發(fā)電活動的影響及其對缺血/再灌注( I/R)時自發(fā)電活動改變的影響。方法:采用標準玻璃微電極細胞內(nèi)電位記錄技術觀測外源性NO供體硝普鈉( SNP)對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響及其對I/R時該電位改變的影響。結果: 1、10、100 μmol/L SNP呈濃度依賴性地導致4相自動除極速度( VDD)和自發(fā)放電頻率( RPF)明顯增加，但1 000 μmol/L SNP的效應不明顯。SNP呈濃度依賴性地導致最大舒張電位( MDP)絕對值和動作電位幅度( APA)增大，0相最大除極速度( V(max))加快，復極50%和90%時間( APD(50)和APD(90))縮短。缺血10 min組VDD和RPF明顯減慢，APA和V(max)明顯增大，APD(50)和APD(90)明顯延長。與缺血10 min組相比，再灌注10 min組VDD和RPF明顯加快，且常出現(xiàn)節(jié)律不齊，MDP絕對值和APA明顯減小，APD(50)和APD(90)明顯縮短。1、10、100 μmol/L SNP再灌注時可明顯改善缺血造成的VDD和RPF減慢以及再灌注造成的節(jié)律不齊，1 000 μmol/L SNP的上述效應不明顯。各濃度SNP再灌注時均可使缺血造成的APA和APD的改變恢復至對照組水平。結論: SNP可呈濃度依賴性地增加左心室流出道的自律性，并可明顯改善I/R導致的自發(fā)慢反應電位的改變。

［關鍵詞］一氧化氮;缺血再灌注;左心室流出道;自發(fā)慢反應電位

哺乳類的心室流出道在發(fā)生上由動脈球(心球)演化而來，在魚及兩棲類動脈球是位于心室之后的一個獨立興奮和收縮單位，在人胚早期仍有動脈球階段。課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，在豚鼠、大鼠及兔流出道的特定部位存在慢反應自律細胞［1］，并和動脈球一樣具有自動興奮的能力。缺血再灌注( ischemia/reperfusion，I/R)常可導致心律失常，其中90%的特發(fā)性室性心動過速( idiopathic ventricular tachyarrhythmia，IVT)起源于右心室流出道，說明心室流出道部位自律細胞的電生理特性可能與源于流出道心律失常的發(fā)生機制有關。心臟I/R時，一氧化氮( nitric oxide，NO)合成的恢復或給予外源性NO很可能拮抗I/R誘導的損傷［2-3］。為探討NO對I/R時心室流出道電生理特性的影響，本研究應用玻璃微電極細胞內(nèi)電位記錄技術，采用停灌/復灌方法［4-5］模擬I/R，記錄并分析外源性NO供體硝普鈉( sodium nitroprusside，SNP)對I/R離體左心室流出道標本自發(fā)慢反應電位的影響。

材料和方法

1標本制備

健康豚鼠，250～350 g，急性處死后迅速開胸取出心臟，并用O2飽和的改良Locke液( mmol/L; NaCl 157，KCl 5. 6，CaCl22. 1，NaHCO31. 8，葡萄糖5. 6，pH 7. 3～7. 4)經(jīng)冠脈進行灌注沖洗，左心室流出道標本制備參見文獻［1］。制好的標本用不銹鋼針固定于灌流槽( 1. 5 cm×2 cm)內(nèi)的硅橡膠上。用Ο2飽和的改良Locke液進行恒溫( 35℃±1℃)、恒速( 10 mL/min)灌流，標本在灌流液中穩(wěn)定30 min后開始實驗。

2電位引導

采用常規(guī)玻璃微電極細胞內(nèi)電位記錄技術，引導左心室流出道部位的自發(fā)慢反應電位。如能直接記錄到自發(fā)電位，則不再進行刺激，若記錄不到，則將刺激電極置于標本遠離瓣膜一端的心肌組織上，給予波寬2 ms、1 Hz、2倍閾強度的方波刺激，刺激時間由數(shù)秒至數(shù)分鐘不等，直至誘發(fā)出穩(wěn)定的自發(fā)節(jié)律，即停止電刺激開始實驗。引導出的自發(fā)慢反應電位，經(jīng)SWF-1B型高阻抗微電極放大器放大，一路輸入監(jiān)聽器監(jiān)聽，另一路采用RM6280多道生理信號采集處理系統(tǒng)，自動顯示電信號，并分析自發(fā)慢反應電位的各項參數(shù)指標。

3觀測指標

4相自動除極速度( velocity of diastolic depolarization，VDD)、自發(fā)放電頻率( rate of pacemaker firing，RPF)、最大舒張電位( maximal diastolic potential，MDP)、0相最大除極速度( maximal rate of depolarization，Vmax)、動作電位幅度( amplitude of action potential，APA)、復極50%時間( 50% of duration of action potential，APD50)和APD90。

4實驗過程和分組

待自發(fā)節(jié)律穩(wěn)定30 min后，開始采集一組正常的自發(fā)慢反應電位作對照，然后采用一定濃度的藥液進行灌流，實時記錄并分析各種因素對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響。為保證藥效，各種藥液均在實驗前1 h內(nèi)配制。實驗分組如下: ( 1) SNP對豚鼠左心室流出道自律性電活動的影響研究: SNP分為4個濃度組: 1、10、100、1 000 μmol/L SNP組，每個濃度組灌流10 min; ( 2) SNP對I/R豚鼠左心室流出道自律性電活動改變的影響研究:采集對照自發(fā)慢反應電位，停灌10 min待電位出現(xiàn)明顯改變后，再分別以含有1、10、100、1 000 μmol/L SNP的灌流液再灌10 min，分別記錄對照組、停灌10 min組( I 10 min)和不同濃度SNP再灌10 min組( SNP + R 10 min)自發(fā)慢反應電位的改變; ( 3) I/R時豚鼠左心室流出道自律性電活動的改變研究:采集對照自發(fā)慢反應電位，停灌10 min模擬缺血，然后以正常灌流液再灌，分別記錄對照組、停灌10 min組( I 10 min)、再灌10 min組( R 10min)自發(fā)慢反應電位的改變，作為SNP對I/R電生理效應的對照。

5統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差( mean±SD)表示，給藥前后各項指標采用自身配對t檢驗，應用SPSS 15. 0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 SNP對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響

SNP可呈濃度依賴性導致左心室流出道自發(fā)慢反應電位VDD和RPF逐漸加快，100 μmol/L SNP組達最大效應，1 000 μmol/L SNP組VDD和RPF的加快效應不明顯。各個濃度SNP灌流過程中，自發(fā)節(jié)律平穩(wěn)規(guī)整。沖洗10 min，自發(fā)節(jié)律恢復至給藥前水平，見圖1、2。

Figure 1.Effects of SNP on the spontaneous slow action potentials of guinea-pig left ventricular outflow tract.圖1　SNP對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響

1、10和100 μmol/L SNP灌流10 min，RPF與對照組相比均有顯著差異( P＜0. 05)，1 000 μmol/L SNP組RPF相對于對照組無明顯加快。與10 μmol/L SNP組相比，100 μmol/L SNP組RPF明顯加快( P＜0. 05)。

10和100μmol/L SNP灌流10 min，VDD與對照組相比均有顯著差異( P＜0. 05)，但1 μmol/L SNP 組VDD與對照組相比無明顯改變。1 000 μmol/L SNP組VDD與對照組相比無明顯加快，與100 μmol/L SNP組相比反而明顯減慢( P＜0. 05)。

與對照組相比，MDP絕對值呈濃度依賴性增大，1～1000 μmo/L SNP均可使VPA增大，Vmax呈濃度依賴性加快，以1 000 μmol/L SNP效應最明顯，100 和1 000 μmol/L SNP組APD50和APD90顯著縮短，其中APD90的縮短更明顯( P＜0. 01)，見圖1、2。

2 SNP對I/R過程中左心室流出道自發(fā)慢反應電位改變的影響

2.1SNP對I/R過程中VDD和RPF改變的影響與對照組相比，各個實驗組缺血10 min組VDD和RPF均顯著減慢( P＜0. 05)。缺血10 min后SNP再灌，與缺血10 min組相比，10和100 μmol/L SNP + R 組VDD明顯加快( P＜0. 05)，1、10和100 μmol/L SNP + R組RPF明顯加快( P＜0. 05)，但與對照組相比無顯著差異，VDD和RPF逐漸恢復至對照組水平。1 000 μmol/L SNP + R組對缺血10 min組的VDD和RPF減慢無明顯影響。SNP改善缺血10 min引起的VDD和RPF改變也呈現(xiàn)濃度依賴性，以100 μmol/L SNP + R組效應最明顯，1 000 μmol/L SNP + R組反而相對較弱，見圖3、4。

缺血10 min后正常灌流液再灌，再灌注2 min 組VDD和RPF明顯加快，與對照組和缺血10 min組相比均有顯著差異，且再灌注至5 min的過程中，自發(fā)節(jié)律不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)節(jié)律不齊，有二聯(lián)律、三聯(lián)律的出現(xiàn)。再灌注10 min組VDD和RPF明顯減慢( P＜0. 05)，RPF恢復至接近對照組水平，VDD與對照組相比仍明顯加快( P＜0. 05)。各個濃度SNP + R過程中，很少出現(xiàn)節(jié)律不齊，自發(fā)節(jié)律平穩(wěn)規(guī)整(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2SNP對I/R過程中MDP、Vmax和APA改變的影響與對照組相比，缺血10 min組MDP絕對值和APA均有所增大，Vmax加快，部分表現(xiàn)為差異顯著( P＜0. 05)。與缺血10 min組相比，正常灌流液再灌注10 min組MDP絕對值和APA明顯減小( P＜0. 05)，Vmax明顯減慢( P＜0. 05)，MDP絕對值和APA恢復至對照組水平。

與缺血10 min組相比，1 μmol/L SNP + R組和100 μmol/L SNP + R組MDP絕對值明顯減小( P＜0. 05)，1和1 000 μmol/L SNP + R組APA明顯減小( P＜0. 05)，而100 μmol/L SNP + R組APA反而明顯增大( P＜0. 05)，Vmax變化不明顯，見圖3、4。

Figure 2.Effects of SNP on spontaneous slow action potentials of guinea-pig left ventricular outflow tract.Mean±SD.n =8.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs 1 μmol/L SNP;△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs 10 μmol/L SNP;☆P＜0. 05 vs 100 μmol/L SNP.圖2　SNP對豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位各項參數(shù)指標的影響

2.3SNP對I/R過程中APD50和APD90改變的影響

與對照組相比，各個實驗組缺血10 min組APD50明顯延長( P＜0. 05)。與缺血10 min組相比，正常灌流液、再灌注10 min組以及1、10和100 μmol/L SNP + R組APD50均顯著縮短( P＜0. 05)，恢復至對照組水平。1 000 μmol/L SNP + R組APD50恢復不明顯，見圖4。

與對照組相比，各個實驗組缺血10 min組APD90明顯延長( P＜0. 05)。與缺血10 min組相比，各個濃度SNP + R組APD90均顯著縮短( P＜0. 05)。與缺血10 min組相比，正常灌流液再灌注10 min組APD90也顯著縮短( P＜0. 01)，見圖4。

討論

臨床資料表明特發(fā)性室速、早搏等心律失常，與流出道的結構、形態(tài)和功能異常有關。形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，在主動脈瓣根部和心室肌交界的部位觀察到一類似月牙形的淡染區(qū)域［6］，與記錄到慢反應動作電位的位置一致，該區(qū)域細胞形態(tài)類似于P細胞，提示該類細胞可能是產(chǎn)生慢反應動作電位的自律細胞團。相關研究表明，該部位的自律性慢反應動作電位特征和離子流基礎與竇房結P細胞相似［7］。說明流出道仍和動脈球一樣具有自動興奮的能力，在心臟節(jié)律異常時其自發(fā)節(jié)律可表現(xiàn)出來，參與源于流出道的心律失常的發(fā)生。

Figure 3.Effects of SNP on the spontaneous slow action potentials of guinea-pig left ventricular outflow tract under the conditions of I/R.圖3　SNP對I/R豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位的影響

Figure 4.Effects of SNP on spontaneous slow action potentials of guinea-pig left ventricular outflow tract under the conditions of I/R.Mean±SD.n =8.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs I 10 min.圖4　SNP對I/R豚鼠左心室流出道自發(fā)慢反應電位各項參數(shù)指標的影響

一氧化氮/一氧化氮合酶系統(tǒng)在多種心血管疾病如冠心病、心力衰竭等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。外源性NO供體SNP和嗎啉-斯德酮亞胺( 3-morpholinosydnonimine，SIN-1)對豚鼠離體心率呈高濃度( mmol/L)減慢之，低濃度( nmol/L～μmol/L)增快之的雙重效應［8］。本實驗中，外源性NO供體SNP對豚鼠離體心室流出道自發(fā)節(jié)律的效應也呈現(xiàn)為濃度依賴性，1、10和100 μmol/L SNP可呈濃度依賴性增加RPF和VDD，而1 000 μmol/L SNP加快自發(fā)節(jié)律的效應明顯減弱。在NO對兔竇房結自律性的研究中，給予小濃度選擇性If阻斷劑CsCl可部分抑制NO引起的VDD和RPF增快，而ICa-L特異性阻斷劑nifedipine對于NO引起的VDD和RPF加快無明顯抑制［9］。本實驗中SNP引起的VDD和RPF加快效應可能與If電流增加有關。NO對ICa-L的效應不同文獻報道不一致，可增強、減弱或無明顯效應［10］。本實驗中，SNP可呈濃度依賴性導致Vmax和APA增加，說明其可能通過增強ICa-L來增加鈣離子內(nèi)流，具體機制還有待進一步實驗證實。

NO是參與心肌I/R病理生理過程中的重要氣體分子。在大鼠心臟缺血再灌注早期，總一氧化氮合酶和內(nèi)皮性一氧化氮合酶活性降低，心肌NO含量明顯減少［11-12］。缺血對竇房結起搏細胞的研究表明，缺血可顯著增強I，但卻明顯抑制了I［13］，

Ca-LCa-T同時KATP的開放，K+的外流進行性衰減減慢，可能是本實驗中采用停灌模擬缺血引起左心室流出道VDD和RPF明顯減慢，Vmax明顯加快，APA明顯增大的離子基礎。本實驗中缺血10 min組APD50和APD90明顯延長，與缺血對竇房結自發(fā)電活動的影響的相關報道一致［14］。再灌注時的細胞內(nèi)鈣超載，細胞內(nèi)外鈣濃度梯度降低，ICa-L受到抑制，L型鈣電流峰值電流密度明顯下降［15］，而導致再灌注時心室流出道自發(fā)慢反應電位Vmax減慢，APA減小。I/R時APD50和APD90的縮短可能源于缺血缺氧過程中自發(fā)開放的少量胞膜KATP通道。APD的縮短導致有效不應期縮短，易誘發(fā)心室流出道后除極而參與再灌注心律失常的發(fā)生。離體心室流出道的VDD和RPF在再灌注2 min時明顯加快，再灌至5 min過程中常出現(xiàn)節(jié)律不齊，再灌注10 min組VDD和RPF逐漸恢復至對照組水平。若再灌注過程中補充不同濃度外源性NO供體SNP可顯著改善缺血造成的自發(fā)節(jié)律減慢和再灌注造成的節(jié)律不齊，該效應表現(xiàn)為濃度依賴性，以10 μmol/L和100 μmol/L SNP的效應較好，說明給予一定濃度的外源性NO可明顯改善I/R損傷。

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Effects of nitric oxide on spontaneous action potentials of guinea-pig left ventricular outflow tract under the conditions of ischemia/reperfusion

ZHAO Lan-ping1，XUE Shu-fang1，CHEN Yan-jing2，WANG Xue-fang1，CHEN Li-feng1
(1Department of Physiological，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China;2Institute of Basic Theories，China A-cademy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China.E-mail: zhaolp2009@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the electrophysiological effects of nitric oxide ( NO) on the pacemaker cells in guinea-pig left ventricular outflow tract under the condition of ischemia/reperfusion ( I/R).METHODS: The spontaneous slow action potentials of guinea-pig left ventricular outflow tract were recorded by conventional intracellular microelectrode technique.The effects of NO donor sodium nitroprusside ( SNP) on the spontaneous slow action potentials under normal or I/R condition were investigated.RESULTS: SNP at concentrations of 1，10 and 100 μmol/L but not 1000 μmol/L significantly increased velocity of diastolic depolarization ( VDD) and rate of pacemaker firing ( RPF)，SNP at concentrations of 1，10，100 and 1 000 μmol/L notably increased maximal diastolic potential ( MDP)，amplitude of action potential ( APA) and maximal rate of depolarization ( V(max))，shortened 50% and 90% of the duration ( APD(50)and APD(90)).In ischemia 10 min group，VDD and RPF were significantly decreased，APA and V(max)were notably increased，and APD(50)and APD(90)were markedly lengthened compared with control group.In reperfusion 10 min group，VDD and RPF were significantly increased，MDP and APA were notably decreased，and APD(50)and APD(90)were markedly shortened compared with I 10 min group.In reperfusin 10 min group，the pacemaker activity was always irregular.In reperfusion 10 min group，the parameters of spontaneous slow action potentials restored to the levels of control group except for VDD and V(max).In 1，10 and 100book=1167,ebook=23μmol/L SNP + R groups，VDD and RPF were significantly increased than in ischemia 10 min group.In 1，10，100 and 1 000 μmol/L SNP + R groups，APA，APD(50)and APD(90)were restored to the levels of control group.CONCLUSION: SNP significantly increases the spontaneous activity of left ventricular outflow tract，and relieves the effects of I/R on the spontaneous slow action potential markedly.

［KEY WORDS］Nitric oxide; Ischemia/reperfusion; Left ventricular outflow tract; Spontaneous slow action potential

通訊作者△Tel: 0313-4029313; E-mail: zhaolp2009@126.com

*［基金項目］河北省衛(wèi)生廳?醫(yī)學科學研究重點項目( No.20130038) ;河北北方學院創(chuàng)新人才培育項目( No.CXRC1324)

［收稿日期］2015-03-11［修回日期］2015-05-07

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1166-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.003