郭健民 章嵐

1. 山東體育學(xué)院研究生教育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250102 2.上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438

自噬是細(xì)胞的一種自我消化行為，是真核細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器的主要代謝過程[1]。在這個(gè)過程中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物被包被進(jìn)囊泡，并與溶酶體相融合形成自噬溶酶體，其中的內(nèi)容物被降解以滿足細(xì)胞新陳代謝和更新細(xì)胞器的需求[2]。自噬在所有的細(xì)胞中均可發(fā)生，誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激的因素如缺氧、熱量限制、氧化應(yīng)激的積累等均可誘導(dǎo)自噬。自噬主要有三種類型：大自噬、小自噬和分子伴侶自噬[3]，我們通常所說的自噬是指大自噬。一般情況下自噬分為四個(gè)主要步驟：啟動(dòng)、延伸、成熟和降解。Beclin-1、LC3(microtubuleassociated protein 1 A/1B light chain 3)、p62以及自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)參與自噬的主要過程，并被作為常用的自噬標(biāo)志物[4]。自噬在正常和應(yīng)激情況下均可調(diào)控細(xì)胞死亡、控制細(xì)胞生長和分化，已有的研究表明自噬可能是通過細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換，來改變細(xì)胞分化和發(fā)育過程中結(jié)構(gòu)的變化，但其作用機(jī)制尚未完全明確[1]。

成骨細(xì)胞是由多能間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的單核細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞也可以分化為成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，該分化過程受相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控[5]。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。成骨細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基質(zhì)礦化調(diào)節(jié)因子，以此參與早期的骨形成和晚期的骨重建。成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成主要包括成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化三個(gè)過程，該過程受到嚴(yán)格的調(diào)控，若調(diào)控異常會(huì)導(dǎo)致包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的骨疾病發(fā)生[6]。最新研究表明自噬相關(guān)基因介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程，同時(shí)在成骨細(xì)胞的活性、增殖、凋亡、分化以及骨基質(zhì)的礦化中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)控作用(表1)。此外自噬還可通過調(diào)控成骨細(xì)胞功能活性，在骨質(zhì)疏松和骨折愈合中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

表1 自噬相關(guān)基因?qū)Τ晒羌?xì)胞的影響Table 1 The effect of autophagy-related genes on osteoblasts

1 自噬對(duì)成骨細(xì)胞形成的調(diào)控

成骨細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)骨形成和發(fā)育[7]。間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化受到相關(guān)的成骨分化因子Runx2(runt-related transcription factor 2)、PPARγ2(peroxisome proliferator-activated receptor γ2)、Osterix、BMP(bone morphogenetic protein)等的調(diào)控[5]，最新研究發(fā)現(xiàn)自噬在該分化過程中呈現(xiàn)不同的水平，并通過影響成骨相關(guān)因子的表達(dá)參與調(diào)控該過程。Homma等[8]研究發(fā)現(xiàn)在hMSCs(human mesenchyymal stem cells)向成骨細(xì)胞分化的過程中LC3B的表達(dá)顯著增加，而通過敲除ATG7抑制hMSCs自噬后，在14 d時(shí)鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少，這表明自噬可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。此外Huang等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，miR-211和ATG14的表達(dá)均顯著增加，使用siRNA抑制miR-211或ATG14的表達(dá)后，成骨分化標(biāo)志物Osteocalcin、OPN(osteopontin)、Runx2的表達(dá)以及ALP(alkaline phosphatase)的活性均下降，該研究還發(fā)現(xiàn)抑制miR-211的表達(dá)后，ATG14蛋白和mRNA的表達(dá)也會(huì)相應(yīng)的減少，這表明自噬相關(guān)基因介導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程，而microRNA作為調(diào)控自噬相關(guān)基因的上游也參與其中。Ichimura等[10]研究發(fā)現(xiàn)長時(shí)間使用艾滋病蛋白Nef干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞，會(huì)抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其衰老，并且會(huì)抑制LC3、Beclin-1的表達(dá)，增加P62的表達(dá)，同時(shí)還會(huì)使成骨分化標(biāo)志物Runx2和Osteocalcin的表達(dá)降低，進(jìn)而抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而使用雷帕霉素激活細(xì)胞自噬可有效的反轉(zhuǎn)Nef對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞的損害，這表明在應(yīng)激情況下自噬也參與間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程。

2 自噬對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響

2.1 自噬對(duì)成骨細(xì)胞活力、凋亡、增殖的影響

自噬是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，在不同的應(yīng)激狀況下適度激活自噬可有效的保護(hù)成骨細(xì)胞的活性和功能，但過度激活自噬或抑制自噬均會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。地塞米松是一種常見的糖皮質(zhì)激素，常作為抗炎藥和免疫抑制藥物用于各種疾病的治療。長期或者過量使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和股骨頭壞死[11-12]，而最新研究表明地塞米松過度激活成骨細(xì)胞自噬，這可能是導(dǎo)致上述疾病的主要原因。Kang等[13]研究發(fā)現(xiàn)使用0.1、1、10 μmol/L的地塞米松干預(yù)MC3T3-E1成骨細(xì)胞24 h后，可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，增加成骨細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞活性，同時(shí)加入地塞米松和自噬抑制劑3-MA(3-Methyladenine)后，成骨細(xì)胞活性增加、凋亡率下降，這表明在較高劑量(>10-8mol/L)的地塞米松干預(yù)下自噬對(duì)細(xì)胞具有損害作用。Kenanidis等[14]研究發(fā)現(xiàn)低劑量的地塞米松(10-8、10-9mol/L)可顯著增加細(xì)胞活性，其中10-8mol/L的地塞米松誘導(dǎo)自噬的效果最佳，自噬在6 h時(shí)達(dá)到峰值，同時(shí)加入地塞米松(10-8mol/L)和3-MA后，細(xì)胞活性降低，且在正常情況下抑制自噬對(duì)細(xì)胞活性未產(chǎn)生顯著影響，這表明在低劑量的地塞米松干預(yù)下自噬對(duì)細(xì)胞活性具有保護(hù)作用。上述研究結(jié)果表明低劑量的地塞米松可適度激活自噬，對(duì)成骨細(xì)胞有保護(hù)、促進(jìn)作用，而高劑量的地塞米松則會(huì)過度激活自噬，對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，這為進(jìn)一步明確糖皮質(zhì)激素對(duì)人體骨骼影響的機(jī)制提供了有力的依據(jù)。

已有研究[15-16]表明自噬介導(dǎo)了骨骼疾病治療藥物發(fā)揮功效的過程，同時(shí)過度的激活或抑制自噬也被認(rèn)為是某些藥物如雙膦酸鹽產(chǎn)生毒副作用的主要原因。雙膦酸鹽是常見的骨質(zhì)疏松治療藥物，但長期使用會(huì)加速骨骼病變，嚴(yán)重的可引起顎骨壞死。Levine等[17]研究發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽會(huì)降低成骨細(xì)胞(hFOB 1.19)的活性并誘導(dǎo)其凋亡，高良姜素則可有效的激活成骨細(xì)胞自噬，進(jìn)而反轉(zhuǎn)雙膦酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞的損害，但抑制自噬后高良姜素對(duì)成骨細(xì)胞的保護(hù)作用減弱，這表明類黃酮可通過激活細(xì)胞自噬來維持細(xì)胞的活性。氨基葡萄糖是治療骨性關(guān)節(jié)炎的有效藥物，但其對(duì)成骨細(xì)胞的影響尚不明確。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)低劑量(<0.6 mmol/L)的氨基葡萄糖在24 h和48 h時(shí)可顯著增加成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而高劑量(>0.8 mmol/L)的氨基葡萄糖會(huì)顯著降低細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞增殖和自噬；同時(shí)使用自噬抑制劑3-MA和低劑量的氨基葡萄糖干預(yù)成骨細(xì)胞48 h后，成骨細(xì)胞中自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin 1的表達(dá)增加，p62表達(dá)降低，同時(shí)細(xì)胞活性和增殖顯著降低，這表明在低劑量的氨基葡萄糖干預(yù)下，自噬可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。鉭納米材料是比鈦更好的生物替換材料，其具有更高的潤濕性和更大的表面能，可以更好的促進(jìn)早期生物固定[19]。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)10μg/mL的鉭納米粒子可使MC3T3-E1細(xì)胞的活性增加20% 和18.7%，同時(shí)增加LC3B的表達(dá)，降低p62的表達(dá)；使用鉭納米粒子干預(yù)成骨細(xì)胞24 h后，加入雷帕霉素或3-MA干預(yù)1 h發(fā)現(xiàn)，激活自噬可顯著增加成骨細(xì)胞活性，而抑制自噬可以逆轉(zhuǎn)鉭納米粒子對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用，這表明鉭納米粒子刺激下自噬可促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性。

在大多數(shù)應(yīng)激情況下，適宜的自噬都會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞起到相應(yīng)的保護(hù)作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并減少凋亡。自噬介導(dǎo)了各類骨疾病治療藥物對(duì)成骨細(xì)胞的影響，但目前自噬影響成骨細(xì)胞活性的機(jī)制尚未完全闡明。已有的研究[21]表明自噬可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1(divalent metal transporter 1)和相關(guān)的信號(hào)通路RAGE/Raf/MEK/ERK[22]實(shí)現(xiàn)對(duì)成骨細(xì)胞活性的調(diào)控。明確自噬的調(diào)控機(jī)制并將其應(yīng)用于臨床骨骼疾病藥物的研發(fā)將是未來的一大研究熱點(diǎn)。

2.2 自噬對(duì)成骨細(xì)胞骨形成作用的影響

成骨細(xì)胞在骨形成和骨重塑中發(fā)揮重要的作用，其通過骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化來控制骨重塑。細(xì)胞外基質(zhì)礦化發(fā)生在成骨細(xì)胞分化的終末期，并被認(rèn)為是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志[23]。已有研究[24-25]表明成骨細(xì)胞的分化可以影響骨形成，成骨細(xì)胞分化和功能的缺失會(huì)導(dǎo)致各種疾病如：骨質(zhì)疏松、骨折愈合遲緩、股骨頭壞死等。無論是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還是在體實(shí)驗(yàn)中都證實(shí)，自噬對(duì)成骨細(xì)胞的功能產(chǎn)生一定的影響。Neve等[26]研究發(fā)現(xiàn)在MC3T3-E1細(xì)胞中激活A(yù)MPK(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase)可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬，增加LC3B的表達(dá)、降低p62的表達(dá)，同時(shí)還可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化，使用3-MA抑制成骨細(xì)胞自噬后，成骨分化標(biāo)志物ALP、OCN和Runx2的表達(dá)下降，這表明在AMPK活化的情況下自噬對(duì)成骨細(xì)胞的骨形成具有促進(jìn)作用。Nollet等[27]研究發(fā)現(xiàn)在正常情況下，抑制或激活自噬不會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物Runx2、Colla1、OCN的表達(dá)產(chǎn)生影響，而在有地塞米松干預(yù)的情況下抑制自噬會(huì)降低上述三個(gè)成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)，激活自噬會(huì)增加這三個(gè)基因的表達(dá)。Ozeki等[28]研究發(fā)現(xiàn)10 μmol/L的山奈酚不會(huì)對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的活性產(chǎn)生顯著影響，但可增加Runx2、Osterix、BMP-2 和I型膠原的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和礦化，同時(shí)Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)增加、P62表達(dá)降低，加入3-MA抑制自噬后，成骨分化標(biāo)志物Runx2、Osterix、BMP-2的表達(dá)降低，這表明在山奈酚干預(yù)下自噬可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化。Ozeki等[29]研究發(fā)現(xiàn)BMP-2可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化同時(shí)增加ATG7的表達(dá)，使用siRNA抑制ATG7的表達(dá)后，成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物BGLAP(bone gamma carboxyglutamate protein)、SPP1(secretedphosphoprotein1)和Osterix的表達(dá)減少，反轉(zhuǎn)了BMP-2對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用，這表明BMP可通過增加自噬來促進(jìn)成骨分化。

上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在正常情況下激活或抑制自噬不會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞的分化和礦化產(chǎn)生影響，但在地塞米松、山奈酚、AMPK活化等情況下，自噬可有效的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨基質(zhì)的礦化。此外在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)自噬影響成骨細(xì)胞分化和骨生成。ATG7參與吞噬泡的伸長和LC3的脂化[30]。Puri等[31]通過雜合子小鼠雜交建立成骨細(xì)胞譜系缺失ATG7的模型發(fā)現(xiàn)，ATG7缺失后小鼠的骨量、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度均顯著下降，同時(shí)成骨細(xì)胞的數(shù)量以及骨生成速率也顯著下降，這表明抑制成骨細(xì)胞自噬水平會(huì)使成骨細(xì)胞的功能受限。Quarles等[32]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠成骨細(xì)胞中敲除p62后，小鼠的骨量、骨小梁厚度、成骨細(xì)胞的數(shù)量均顯著低于野生型小鼠，同時(shí)還能激活NF-κB通路，而NF-κB抑制劑 可反轉(zhuǎn)p62缺失對(duì)成骨分化標(biāo)志物表達(dá)的影響，這表明在成骨細(xì)胞中自噬缺失會(huì)激活NF-κB通路進(jìn)而抑制成骨分化。Beclin-1參與自噬的啟動(dòng)過程，并且可以調(diào)控自噬體的形成和成熟[33-34]。Tchetina等[35]研究發(fā)現(xiàn)在成骨細(xì)胞系UMR-106和原代成骨細(xì)胞礦化的過程中LC3的表達(dá)均顯著增加，抑制UMR-106細(xì)胞中ATG7和Beclin-1的表達(dá)后，礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著減少，此外該研究還通過建立成骨細(xì)胞中限定性敲除基因ATG5的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，ATG5的缺失同樣會(huì)降低成骨細(xì)胞的礦化能力，這表明自噬在成骨細(xì)胞礦化的過程起關(guān)鍵性的促進(jìn)作用。Weinstein等[36]研究發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量的褪黑素可增加2型糖尿病小鼠的骨密度、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度，同時(shí)降低骨組織中LC3和Beclin-1的表達(dá)；通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖會(huì)使hFOB 1.19 細(xì)胞自噬水平提高，成骨分化能力降低，而使用褪黑素和3-MA均可有效的抑制成骨細(xì)胞自噬，提高成骨標(biāo)志物ALP和OCN的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨分化。

早期的骨骼發(fā)育以及后期的骨重塑中，骨形成都是持續(xù)存在的；骨形成活動(dòng)異常會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常和骨骼疾病。上述研究表明自噬相關(guān)基因ATG7、Beclin-1、p62、ATG5等均介導(dǎo)了成骨細(xì)胞的骨形成過程。通過明確自噬對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響，為探索骨骼病理狀況發(fā)生機(jī)制提供有力的理論支撐。

3 自噬在骨疾病中對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)控

骨質(zhì)疏松是一種以全身性骨量減少以及骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的疾病，會(huì)導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低、脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病人和骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中成骨細(xì)胞的活性均顯著下降[37]。Yang等[38]研究發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周血中 mTOR、Runx2和ALPL的表達(dá)較正常人下降，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)mTOR的表達(dá)與Runx2的表達(dá)正相關(guān)，股骨骨密度與Runx2的表達(dá)存在正相關(guān)，這表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨密度的降低可能與自噬相關(guān)基因mTOR存在關(guān)聯(lián)。對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠給于β-蛻皮甾酮干預(yù)后，大鼠成骨標(biāo)志物Runx2、BMP2與自噬標(biāo)志物Beclin-1、ATG5、LC3I/II、Bcl-2的表達(dá)均顯著增加，microCT檢測發(fā)現(xiàn)大鼠椎骨的骨密度、骨量、骨小梁的數(shù)量、骨小梁厚度均顯著增加[39]，這表明自噬水平的增加與骨質(zhì)疏松的緩解存在關(guān)聯(lián)。

骨折是一種常見的損傷，骨折愈合遲緩或骨不連在骨折中發(fā)生的概率為5%～10%[40]。Zhang等[41]研究發(fā)現(xiàn)在股骨骨折的大鼠模型中，骨組織自噬水平在24 h時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸下降，但在3天和7天時(shí)仍高于對(duì)照組；使用雷帕霉素干預(yù)后骨折的愈合顯著加快，并可增加細(xì)胞的自噬水平，降低Bax的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，顯著減小骨折骨小梁間隙、增加骨小梁周圍成骨細(xì)胞數(shù)量。Zhu等[42]的研究也發(fā)現(xiàn)對(duì)股骨骨折的大鼠給于雷帕霉素干預(yù)后，大鼠骨組織中rpS6的表達(dá)受到抑制，LC3的表達(dá)增加，同時(shí)骨折處愈傷組織礦化和愈傷組織形成增加。這表明在骨折中激活自噬可提高成骨細(xì)胞的活性和增殖、抑制成骨細(xì)胞凋亡、促進(jìn)骨形成進(jìn)而加速骨折愈合。

在骨質(zhì)疏松和骨折中，自噬可通過對(duì)成骨細(xì)胞功能和活性的調(diào)控影響疾病的發(fā)生發(fā)展，這為臨床骨疾病的治療提供潛在的靶點(diǎn)。

4 小結(jié)

眾多的研究表明自噬可通過維持成骨細(xì)胞的活性來維持機(jī)體骨量的平衡。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體實(shí)驗(yàn)也都證實(shí)了自噬在正常情況下和不同的應(yīng)激下，對(duì)成骨前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程以及成骨細(xì)胞的活性、增殖、凋亡和礦化等產(chǎn)生一定影響。過度激活或抑制自噬均會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害，適宜的自噬水平則會(huì)對(duì)成骨細(xì)胞的功能活性起促進(jìn)作用，但其作用機(jī)制尚未完全明確。此外在骨質(zhì)疏松等骨疾病中自噬發(fā)揮重要的調(diào)控作用[43]，目前的研究主要集中于自噬的作用機(jī)制，未來需要通過更多的臨床實(shí)驗(yàn)來探究自噬功能障礙與骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系，從而研究出預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松新方法。