匡嘉兵，徐 昊，張克良，沈 波，許閆嚴(yán)

(武漢市普愛醫(yī)院暨華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院，西院骨一科，武漢 430030)

microRNAs(miRNAs)是一類長度約為22個(gè)核苷酸、保守、進(jìn)化的非編碼單鏈RNA小分子[1]。miRNA存在于果蠅、小鼠、人類和植物等基因組中，均為內(nèi)源性表達(dá)[2]。研究已經(jīng)證實(shí)，miRNAs在多數(shù)腫瘤中表達(dá)失調(diào)，包括結(jié)直腸癌、淋巴瘤、乳腺癌、肝細(xì)胞癌等[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-494會參與腦缺血、神經(jīng)變性病、多發(fā)性硬化、腦腫瘤以及脊髓病變等多種生理疾病中[4-6]。骨質(zhì)疏松癥是世界上常見的病癥，發(fā)病率極高。成骨細(xì)胞在骨代謝中起著重要的作用，參與骨吸收和骨重建的過程[7]。當(dāng)機(jī)體的骨吸收大于骨重建時(shí)，就會表現(xiàn)出骨量減少、骨流失以及骨顯微結(jié)構(gòu)被破壞的現(xiàn)象[8]。成骨細(xì)胞是骨代謝的主要功能細(xì)胞，細(xì)胞的增殖和分化能力決定著最終的成骨量[9]。Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)廣泛存在于人類和動(dòng)物的多種細(xì)胞中，屬于I型跨膜蛋白，參與機(jī)體的初級免疫過程，并調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生理功能，例如骨細(xì)胞的代謝和干細(xì)胞的增殖等[10]。此外，TLR介導(dǎo)的炎癥因子的分泌對早期的骨修復(fù)起著重要的作用。人的TLR共分為5個(gè)亞科、10個(gè)亞型。成骨細(xì)胞表面主要表達(dá)TLR-3和TLR-4[11]。本研究即探討TLR-4受體在成骨細(xì)胞分化及基質(zhì)礦化的可能分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠成骨細(xì)胞株 MC3T3-E1購自于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清和青鏈霉素雙抗均購自于美國Gibco公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、β-甘油磷酸鈉和TritonX-100均購于自美國Sigma公司。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物科技有限公司。Von Kossa染色試劑盒購自于湖北百奧斯生物技術(shù)有限公司。TLR-4抗體、β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購自于美國CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 miR-494 mimic轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1

miR-494 mimic及其陰性對照均購自于銳博生物科技有限公司。使用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將MC3T3-E1細(xì)胞分為miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組和陰性對照組。miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組：向培養(yǎng)中加入化學(xué)合成的miR-494 mimic和脂質(zhì)體；陰性對照組：向培養(yǎng)液中加入無義序列miR-494 mimic和脂質(zhì)體。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-494在小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中的表達(dá)

采用Trizol提取法提取細(xì)胞中的總RNA，按照Micro RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：1 μL總RNA，4 μL 5×Reaction Mix，2 μL 10×Super Script Enzyme Mix，加入雙蒸水將體系補(bǔ)足至20 μL，混勻后離心。反應(yīng)條件為：37℃60 min，95℃5 min，置于4℃保存?zhèn)溆谩０凑誵RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL。使用SYBR Green染料法進(jìn)行測定，每個(gè)樣本設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。按照試劑盒說明書的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。miR-494的相對表達(dá)量用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 MTT法檢測小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后的增殖活性

將小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1調(diào)整至適宜濃度后，接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組和miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。孵育細(xì)胞48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μLMTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入150 μL DMSO，37℃下振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測定570 nm處測定吸光度值。

1.2.4 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后ALP活性的測定

陰性對照組和miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后轉(zhuǎn)移至離心管，使用PBS溶液反復(fù)凍融細(xì)胞后，按照ALP測定試劑盒說明書操作，用來評價(jià)小鼠成骨細(xì)胞的分化能力。

1.2.5 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后骨鈣素(osteocalcin，OC)活性的測定

將小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1接種于96孔板，分組同上。培養(yǎng)4 d后，使用骨鈣素放射免疫分析試劑盒測定小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中骨鈣素的活力。

1.2.6 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后礦化結(jié)節(jié)數(shù)的測定

本實(shí)驗(yàn)采用Vonkossa鈣化染色法測定小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后的礦化結(jié)節(jié)數(shù)。將小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1接種于96孔板，分組同上。培養(yǎng)18 d后，使用Vonkossa鈣化液對細(xì)胞進(jìn)行換液，之后采用Vonkossa鈣化染色法對細(xì)胞進(jìn)行染色。各樣本的礦化結(jié)節(jié)形成情況使用HPIAS-100高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)計(jì)算。

1.2.7 Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后TLR-4蛋白的表達(dá)差異

將小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1接種于6孔板，分組同上。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用裂解液充分裂解細(xì)胞后，離心取上清液。使用BCA蛋白濃度試劑盒對提取的總蛋白進(jìn)行定量。使用上樣緩沖液，在沸水浴中使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠電泳選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，在150 Ma下轉(zhuǎn)膜3 h，使用5%的脫脂奶粉封閉2 h。分別使用TLR-4抗體(1∶1000)和β-actin(1∶500)4℃下孵育過夜。使用二抗(1∶5000)在室溫下孵育2 h。使用灰度值軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測miR-494在小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中的表達(dá)

如表1所示，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-494在小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中的表達(dá)量極顯著的低于miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，說明miR-494 mimic轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1成功，使miR-494在小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中過表達(dá)。

表1 miR-494在小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中的表達(dá)(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

2.2 MTT法檢測小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后的增殖活性

本實(shí)驗(yàn)對miR-494 mimic轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1后，MTT法檢測轉(zhuǎn)染0 h、48 h后細(xì)胞增殖率的變化。如表2所示，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率較陰性對照組顯著降低(P<0.05)，證實(shí)miR-494抑制小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的增殖。

2.3 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后ALP活性的測定

本實(shí)驗(yàn)檢測了小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后ALP的活性。結(jié)果如表3所示，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1后，細(xì)胞中ALP的活性顯著受到抑制(P<0.05)。這說明miR-494會使小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中的ALP活力降低。

2.4 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后骨鈣素(OC)活性的測定

在成骨細(xì)胞分化中期，骨鈣素的含量會上升。本實(shí)驗(yàn)測定了miR-494 mimic轉(zhuǎn)染后，小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中骨鈣素的含量。結(jié)果如表4所示，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1后，細(xì)胞中OC的活性顯著受到抑制(P<0.05)。這說明miR-494會使小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中的OC活力降低。

2.5 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后礦化結(jié)節(jié)數(shù)的測定

礦化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞晚期分化的重要標(biāo)志。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目，反映miR-494對成骨細(xì)胞晚期分化的程度。結(jié)果如表5所示，陰性對照組中的成骨細(xì)胞形成了圓形礦化結(jié)節(jié)，且邊界清晰。miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著低于陰性對照組(P<0.05)。說明miR-494會抑制成骨細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)。

2.6 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后TLR-4蛋白的表達(dá)差異

本實(shí)驗(yàn)測定了miR-494 mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞中TLR-4蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果如表6所示，Western blot檢測結(jié)果表明，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中TLR-4蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。說明miR-494會增加小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中TLR-4蛋白的表達(dá)量，即miR-494可能通過TLR-4通路抑制成骨細(xì)胞分化及基質(zhì)礦化。

表2 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后的增殖率(n=16，%)

注：與陰性對照組培養(yǎng)0 h相比，*P<0.05；與陰性對照組培養(yǎng)48 h相比，#P<0.05。Note. Compared with negative control group (Incubation time 0 h),*P<0.05. Compared with negative control group (Incubation time was 48 h),#P<0.05.

表3 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后ALP活性(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

表4 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染前后OC活性(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

表5 小鼠成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成情況比較(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

表6 小鼠成骨細(xì)胞TLR-4蛋白的表達(dá)差異(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

3 討論

骨質(zhì)疏松是臨床常見的骨科疾病，會出現(xiàn)骨骼密度降低、脆性增加、骨折或腰背疼痛等現(xiàn)象[12]。骨骼的礦化是維持人體骨骼正常狀態(tài)的關(guān)鍵，這一過程主要由成熟的成骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，與體內(nèi)的無機(jī)鹽共同完成，從而實(shí)現(xiàn)骨骼的正常代謝[13]。因此，起源于骨髓基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞的成骨細(xì)胞，主要參與增殖、分化以及基質(zhì)鈣化[14]。MC3T3-E1來源于C57BL/6小鼠的顱蓋骨細(xì)胞，具有成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性，因此作為成骨細(xì)胞研究中的體外模型[15]。

在本研究中，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1轉(zhuǎn)染后的miR-494的mRNA的表達(dá)量顯著升高，說明miR-494 mimic轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1，成功使miR-494過表達(dá)。MTT法檢測結(jié)果表明：miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖率較陰性對照組顯著降低，證實(shí)miR-494抑制小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的增殖。

ALP是成骨細(xì)胞膜上所分泌的一種鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞的成熟和鈣化[16]。ALP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量可以作為衡量成骨細(xì)胞分化程度的指標(biāo)，應(yīng)用十分廣泛。ALP的活性會隨著成骨細(xì)胞不斷成熟而呈上升趨勢，當(dāng)骨細(xì)胞的增殖和分化受到抑制時(shí)，成骨細(xì)胞的礦化作用受阻，ALP的活性降低[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的ALP活性顯著低于陰性對照組，說明miR-494會使小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的早期分化能力降低。骨鈣素是維持骨組織正常鈣化的必需因子，ALP和骨鈣素(OC)分別是成骨細(xì)胞分化早期和分化中期的標(biāo)志物[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組MC3T3-E1細(xì)胞中骨鈣素的活力顯著降低。上述結(jié)果提示miR-494具有抑制成骨細(xì)胞MC3T3-E1中期分化的作用。

礦化結(jié)節(jié)是衡量骨細(xì)胞晚期分化程度的指標(biāo)，是成骨細(xì)胞分化成熟的階段，是成骨功能的形態(tài)表現(xiàn)[19]。Von Kossa鈣化染色法的原理是：將礦化基質(zhì)中的碳酸鹽和磷酸鹽轉(zhuǎn)化為碳酸銀和磷酸銀，然后將銀離子還原成銀后進(jìn)行測定。Von Kossa鈣化染色法可以通過礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目，反映成骨細(xì)胞的鈣化程度。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉(zhuǎn)染組MC3T3-E1細(xì)胞中礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目顯著降低。說明miR-494會抑制MC3T3-E1細(xì)胞的礦化。

TLR-4是細(xì)胞膜上一種重要的跨膜受體，不僅參與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，還參與骨代謝功能的調(diào)控[20]。研究證實(shí)，TLR-4受體上調(diào)會抑制骨細(xì)胞的增殖和分化。在成骨細(xì)胞中，TLR-4通路是參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的重要通路之一[21-22]。因此，本研究通過Western blot檢測了小鼠成骨細(xì)胞中TLR-4的蛋白表達(dá)，初步探討miR-494對成骨細(xì)胞的潛在作用機(jī)制。結(jié)果表明，miR-494可上調(diào)成骨細(xì)胞中TLR-4的蛋白表達(dá)，該作用可能是miR-494抑制成骨細(xì)胞增殖和分化的潛在機(jī)制。

綜上所述，miR-494能夠通過TLR-4通路抑制小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1的增殖活力，降低細(xì)胞中ALP、OC的活力，減少成骨細(xì)胞中的礦化結(jié)節(jié)數(shù)，抑制成骨細(xì)胞分化及基質(zhì)礦化。