周廣友，耿　彪，耿　濤，安儒峰，田　芳，劉培慶(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，山東泰安7000;中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州50006)

PARP-2在大鼠心肌肥大中的作用*

周廣友1▲，耿彪1▲，耿濤1，安儒峰1，田芳1，劉培慶2△
(1泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，山東泰安271000;2中山大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006)

［摘要］目的:在細(xì)胞和整體水平研究多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶2( PARP-2)在心肌肥大過程中表達(dá)的變化規(guī)律以及PARP-2對(duì)心肌肥大的調(diào)控作用。方法:健康雄性SD大鼠采用腹主動(dòng)脈縮窄法( AAC)建立心肌肥大動(dòng)物模型，采用real-time PCR和Western blot檢測(cè)PARP-2的mRNA和蛋白表達(dá)變化;使用PARP-2特異性的siRNA干擾序列來處理細(xì)胞后，通過檢測(cè)心肌細(xì)胞表面積及ANF、BNP和β-MHC的mRNA表達(dá)變化來作為評(píng)判心肌細(xì)胞肥大狀況。結(jié)果: AAC大鼠心臟組織中PARP-2的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著上調(diào);在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型中，AngⅡ能時(shí)間和劑量依賴性地上調(diào)PARP-2的mRNA和蛋白表達(dá);用siRNA干擾序列沉默PARP-2能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大。結(jié)論:在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的體外模型和腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的心肌肥大動(dòng)物的體內(nèi)模型中，PARP-2的mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào);特異性沉默PARP-2能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

［關(guān)鍵詞］多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶2;血管緊張素Ⅱ;腹主動(dòng)脈縮窄;心肌肥大

▲并列第1作者

早期心肌肥大是心臟對(duì)機(jī)械負(fù)荷及神經(jīng)體液因子的改變進(jìn)而維持適當(dāng)收縮功能的代償反應(yīng)［1］，但長(zhǎng)期應(yīng)激所導(dǎo)致的持續(xù)性病理性心肌肥大可發(fā)展為心臟擴(kuò)大、充血性心力衰竭和猝死，是心功能惡化及心源性死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［2-3］。因此，研究心肌肥大的機(jī)制及其防治策略具有十分重要的意義。

多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶［poly ( ADP-ribose) polymerases，PARP］是真核細(xì)胞內(nèi)具有多聚腺苷酸二磷酸核糖基［poly ( adenosine diphosphate-ribose)，PAR］催化活性的蛋白酶，是以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)為底物催化合成PAR聚合物，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行翻譯后修飾，該修飾作用于許多蛋白，涉及到染色體的穩(wěn)定，DNA損傷修復(fù)，基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞的增長(zhǎng)、死亡和凋亡等方面［4-6］。很多研究表明PARP家族與心血管疾病密切相關(guān)，PARP的藥理性抑制劑對(duì)于很多心血管疾病的動(dòng)物模型均有明顯改善作用。PARP-1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有PAR修飾活性的蛋白，也是PARP家族中最為典型的成員。PARP-1在心血管疾病中的研究已經(jīng)相當(dāng)深入，其抑制劑在心肌肥厚、心肌缺血及再灌注以及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中均有明顯作用，一些新型的PARP-1抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，主要適應(yīng)癥是惡性腫瘤及嚴(yán)重心血管疾病，并顯示出良好的治療效果［7-9］。

PARP家族的另一重要成員PARP-2與PARP-1具有69%的同源性，晶體結(jié)構(gòu)類似，而且二者是PARP家族目前僅有的能夠因DNA的斷裂或損傷而誘發(fā)其催化活性的成員，但是PARP-2相對(duì)于PARP-1僅占了全部酶活性的5%～10%，二者有不同的DNA結(jié)合位點(diǎn)和蛋白靶點(diǎn)，決定了其不同的生理功能［10-11］。關(guān)于PARP-2在心肌肥大甚至心血管疾病中的作用報(bào)道較少，有待進(jìn)一步研究。

在本研究中，我們檢測(cè)到在血管緊張素Ⅱ( angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大體外模型和腹主動(dòng)脈縮窄( abdominal aortic coarctation，AAC)誘導(dǎo)的心肌肥大體內(nèi)模型中，PARP-2的表達(dá)均明顯上調(diào)。在此基礎(chǔ)上，我們通過采用RNA干擾( RNA interference，RNAi)的方法，首次證實(shí)了下調(diào)PARP-2能夠明顯逆轉(zhuǎn)AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌肥大。上述發(fā)現(xiàn)提示了PARP-2與心肌肥大的密切關(guān)系，也為進(jìn)一步研發(fā)PARP-2特異性的抑制劑防治心肌肥大等心血管疾病提供了科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1材料

出生1～2 d的Sprague-Dawley( SD)大鼠購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)為0067950。PARP-2抗體和AngⅡ購(gòu)自Sigma; PARP-2 siRNA(上海吉瑪公司) ; Lipofectamine 2000( Invitrogen)。

2方法

2.1乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)取出生1～2 d乳鼠心臟，用胰酶消化法，即將剪好的心臟小塊置于配好的胰蛋白酶溶液中，首先冰上冷消化20 min后，37℃水浴多次消化。將乳鼠左心室消化成單細(xì)胞懸液，經(jīng)過差速貼壁分離后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度種于培養(yǎng)皿中，并在DMEM培養(yǎng)基中避光加入0. 1 mmol/L的BrdU以抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h更換無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2大鼠腹主動(dòng)脈縮窄模型的建立雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為2組:假手術(shù)組( sham組)和手術(shù)組( AAC組)，每組各10只。首先腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉( 40 mg/kg)，常規(guī)消毒鋪巾，沿腹腔正中縱行切口，將腹腔打開，分離腹主動(dòng)脈，旁置1根6號(hào)針，使腹主動(dòng)脈縮窄達(dá)70%～80%。假手術(shù)對(duì)照組只分離腹主動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，其它步驟同手術(shù)組一致。

2.3大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)后8周，對(duì)大鼠行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。探頭置于大鼠胸骨左側(cè)，取胸骨旁左室長(zhǎng)軸和短軸切面。利用二維超聲引導(dǎo)M型曲線并進(jìn)行測(cè)量。超聲心動(dòng)檢測(cè)指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑( left ventricular internal dimensions at end-diastole，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑( left ventricular internal dimensions at end-systole，LVIDs)、舒張末期室間隔厚度( interventricular septal wall dimensions at end-diastole，IVSd)、收縮末期室間隔厚度( interventricular septal wall dimensions at end-systole，IVSs)、舒張末期左室后壁厚度( left ventricular posterior wall dimensions at end-diastole，LVPWd)、收縮末期左室后壁厚度( left ventricular posterior wall dimensions at end-systole，LVPWs)、左室長(zhǎng)軸縮短分?jǐn)?shù)( fractional shortening，F(xiàn)S)和射血分?jǐn)?shù)( ejection fraction，EF)。

2.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn)按照TRIzol說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，利用紫外分光光度儀測(cè)定RNA的濃度和純度。參照TaKaRa的SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為: 95℃10 s; 95℃5 s，60℃30 s，循環(huán)50次; 95℃15 s，60℃1 h; 65℃30 s，循環(huán)61次。以PCR反應(yīng)液作為空白對(duì)照，每組樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性和可靠性。所有引物均由英韋創(chuàng)津合成，實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列見表1。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primer used for real-time PCR

2.5Western blot實(shí)驗(yàn)用裂解液提取細(xì)胞和組織中的總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于5%的BSA封閉液中室溫封閉1 h后，TBST洗3次后加入I抗，4℃孵育過夜。用TBST洗膜后加入II抗室溫孵育1 h后。加入ECL發(fā)光液，曝光、顯影、定影。

2.6RNA干擾實(shí)驗(yàn)按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。換用OPTI-MEMI培養(yǎng)基后加入A液( 10 μL干擾序列+ 250 μL OPTI-MEMI培養(yǎng)基)和B液( 5 μL Lipofectamine 2000 + 250 μL OPTI-MEMI培養(yǎng)基)充分混勻，加無血清培養(yǎng)基至2 mL，置于培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件，以多組間單因素方差分析或t檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1AngⅡ誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞肥大模型的建立

采用100 nmol/L濃度的AngⅡ分別刺激心肌細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h，檢測(cè)肥大相關(guān)因子心房鈉尿因子( atrial natriuretic factor，ANF)、腦鈉尿肽( brain natriuretic peptide，BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC) mRNA表達(dá)的變化。如圖1所示，在AngⅡ作用24 h后，心肌細(xì)胞中ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平顯著增加( P＜0. 05)，表明100 nmol/L濃度的AngⅡ刺激24 h可成功誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

Figure 1.The effects of AngⅡ( 100 nmol/L) on the mRNA expression of ANF，BNP and β-MHC detected by realtime PCR.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs 0 h.圖1　AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大模型中肥大基因表達(dá)的變化

2AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型中PARP-2的mRNA和蛋白表達(dá)增加

以real-time PCR和Western blot方法分別檢測(cè)PARP-2的mRNA和蛋白水平變化。如圖2所示，不同濃度的AngⅡ( 0、1、10、100和1 000 nmol/L)分別處理24 h后，PARP-2的mRNA和蛋白表達(dá)隨AngⅡ濃度的增加而明顯增加( P＜0. 05)。選定100 nmol/ L的AngⅡ分別刺激心肌細(xì)胞6 h、12 h、24 h和48 h，檢測(cè)PARP-2的mRNA和蛋白表達(dá)隨時(shí)間增加而上升( P＜0. 05)，超過24 h時(shí)達(dá)到最高。這表明AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大模型中PARP-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加。

Figure 2.The expression of PARP-2 in neonatal rat cardiomyocytes treated with AngⅡ.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control ( 0 nmol/L or 0 h).圖2　AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PARP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化

3腹主動(dòng)脈縮窄致大鼠心肌肥大模型的鑒定

對(duì)大鼠實(shí)施AAC手術(shù)從而建立心肌肥大模型，與假手術(shù)組比較，AAC模型組的IVSd、IVSs、LVPWd 及LVPWs等超聲心動(dòng)參數(shù)均明顯增高( P＜0. 05)，LVIDs明顯下降( P＜0. 05)，見表2。而且心臟體積明顯增大提示AAC模型組大鼠發(fā)生明顯左室肥厚。

表2　各組大鼠超聲心動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 2.Echocardiographic parameters of sham and AAC rats ( Mean±SD.n =8)

將病理切片進(jìn)行HE染色，檢測(cè)肥大相關(guān)因子ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平，與對(duì)照組相比均上升6～10倍，表明AAC術(shù)后大鼠心臟呈現(xiàn)典型的向心性肥厚，動(dòng)物模型建立成功，見圖3。

4心肌肥大動(dòng)物模型中PARP-2蛋白和mRNA的表達(dá)增加明顯

為明確PARP-2在心肌肥大動(dòng)物模型中的變化情況，本實(shí)驗(yàn)分別采用Western blot和real-time PCR法檢測(cè)PARP-2的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)的變化，與假手術(shù)組比較，AAC模型的大鼠心臟中PARP-2的mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著增加，見圖4。

5沉默PARP-2對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響

心肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染48 h之后，分別采用realtime PCR和Western blot檢測(cè)PARP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的變化。通過與正常對(duì)照( control，Con)組和陰性對(duì)照( negative control，Neg)組相比，si003干擾效率最高，達(dá)到80%以上，PARP-2的mRNA水平和蛋白水平均顯著下降，PARP-1蛋白表達(dá)無明顯變化，見圖5，表明干擾序列可特異性地沉默PARP-2。

利用si003序列對(duì)PARP-2進(jìn)行沉默，然后分別通過real-time PCR和激光共聚焦顯微鏡來觀察ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平變化和心肌細(xì)胞表面積的變化。AngⅡ組和陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比較心肌細(xì)胞表面積均明顯增加( P＜0. 05)，但是si003組與AngⅡ組相比心肌細(xì)胞表面積均明顯減小( P＜0. 05)。此外，AngⅡ組相對(duì)于空白對(duì)照組ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平顯著升高( P＜0. 05)，但是si003組與AngⅡ組相比ANF、BNP和β-MHC的mRNA水平顯著下降( P＜0. 05)，與空白對(duì)照組水平一致，見圖5。這表明PARP-2基因沉默能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

Figure 3.A rat model of cardiac hypertrophy induced by abdominal aortic constriction ( AAC).Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05 vs sham.圖3　腹主動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)大鼠心肌肥大模型的建立

Figure 4.PARP-2 mRNA and protein expression was up-regulated in abdominal aortic constriction rats.Mean±SD.n =8.*P＜0. 05 vs sham.圖4　AAC模型中PARP-2蛋白和mRNA表達(dá)的變化

討論

本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)在AngII誘導(dǎo)的體外和AAC誘導(dǎo)的體內(nèi)心肌肥大的模型中，PARP-2的蛋白和mRNA水平均有明顯上升，且沉默PARP-2可以有效逆轉(zhuǎn)AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌肥大，這些研究結(jié)果為利用PARP-2特異性抑制劑來治療和預(yù)防心肌肥大提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為我們后續(xù)研究PARP-2介導(dǎo)心肌肥大的下游分子通路提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Figure 5.PARP-2 knockdown blocked the hypertrophic responses induced by AngⅡ.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs Con;#P＜0. 05 vs AngⅡ.圖5　沉默PARP-2后能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大

PARP家族重要成員之一的PARP-1與心血管疾病是關(guān)系密切，其抑制劑在心肌肥厚、心肌缺血及再灌注、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中均有明顯作用，為臨床上開發(fā)其新型的抑制劑來治療心肌肥大等心血管疾病提供了證據(jù)。然而我們也知道PARP-1作為PARP家族最重要成員，其酶活性達(dá)到了整個(gè)家族的90% ～95%左右，在染色體的穩(wěn)定，DNA損傷修復(fù)，基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞的增長(zhǎng)、死亡和凋亡等方面都有十分重要的生理作用［12］，因此單方面地將其完全抑制，所產(chǎn)生的副作用和不利方面也是不言而喻的。我們所研究的PARP-2在人體內(nèi)大量存在于骨骼肌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、胰腺等組織器官中，其與PARP-1具有69%的同源性，而且晶體結(jié)構(gòu)類似，可以相互作用，功能上互補(bǔ)，但不完全重合［10］。此外二者不同的DNA結(jié)合位點(diǎn)和蛋白靶點(diǎn)，決定了二者不同的生理功能。近年來，關(guān)于PARP-2特殊的生理功能越來越得到人們的廣泛關(guān)注。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果中主要通過“功能缺失”( RNA干擾)的方法，闡明了PARP-2缺失可以有效逆轉(zhuǎn)AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌肥大。由于PARP-2的酶活性只占了該家族酶活性的5%～10%，不會(huì)影響PARP家族正常的生理活性，因此開發(fā)特異性的PARP-2抑制劑對(duì)臨床治療心肌肥大有十分重要的意義。

目前對(duì)于新型的PARP-2選擇性抑制劑的研發(fā)得到人們的廣泛關(guān)注［12］。Moroni等［13］研究表明選擇性的PARP-2抑制劑UPF1069可以增加海馬切片中的細(xì)胞凋亡，但是可以保護(hù)缺血性腦損傷模型中的皮質(zhì)細(xì)胞。因此UPF1069可以作為十分有用的工具開發(fā)PARP-2新的生物學(xué)功能，也可以用來區(qū)分其與PARP家族其它成員在細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡等機(jī)制中的不同。越來越多的人們意識(shí)到PARP-2蛋白在DNA損傷修復(fù)、基因組的穩(wěn)定以及炎癥方面的特殊作用以及PARP-2所參與的特定的分子信號(hào)途徑，為臨床研發(fā)其抑制劑提供了有力證據(jù)以及治療疾病的新的靶點(diǎn)。

我們的結(jié)果也同樣表明，用siRNA干擾序列特異性沉默PARP-2后能夠有效逆轉(zhuǎn)AngⅡ所誘導(dǎo)的心肌肥大，對(duì)開發(fā)選擇性的PARP-2抑制劑用于臨床治療心肌肥大提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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Role of PARP-2 in cardiac hypertrophy in rats

ZHOU Guang-you1，GENG Biao1，GENG Tao1，AN Ru-feng1，TIAN Fang1，LIU Peiqing2
(1Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Taishan Medical University，Taian 271000，China;2Department of Pharmacology and Toxicology，School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China.E-mail: liupei_qing1964@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the expression of poly( ADP-ribose) polymerase-2 ( PARP-2) during rat cardiac hypertrophy in vitro and in vivo，and to explore the effects of PARP-2 on the cardiac hypertrophy.METHODS: Abdominal aortic coarctation ( AAC) was performed to establish a model of pressure overload-induced cardiac hypertrophy in SD rats.The expression of PARP-2 at mRNA and protein levels in the myocardium was determined by real-time PCR and Western blot.The hypertrophy model of the cardiomyocytes was induced by treating the cells with angiotensinⅡ( AngⅡ).PARP-2 was knocked down by siRNAs in neonatal rat cardiomyocytes and the cardiomyocyte hypertrophy was evaluated by measuring the mRNA levels of ANF，BNP，and β-MHC and the cellular surface area.RESULTS: The expression of PARP-2 at mRNA and protein levels was both increased in the AAC rats as compared with those in the sham animals.The expression of PARP-2 at mRNA and protein levels was also increased in a time-and concentration-dependent manner in AngⅡ-induced hypertrophy model of the cardiomyocytes.In the neonatal rat cardiomyocytes，knockdown of PARP-2 expression by siRNA attenuated AngⅡ-induced cardiac hypertrophy of the cardiomyocytes，indicating that endogenous PARP-2 played a positive regulatory role in cardiac hypertrophy.CONCLUSION: The mRNA and protein levels of PARP-2 increase in the in vitro and in vivo models of cardiac hypertrophy.Knockdown of PARP-2 protects cardiomyocytes from hypertrophy.

［KEY WORDS］Poly( ADP-ribose) polymerase-2; AngiotensinⅡ; Abdominal aortic coarctation; Cardiac hypertrophy

通訊作者△Tel: 020-39943116; E-mail: liupei_qing1964@163.com

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.81072641; No.81273499)

［收稿日期］2015-01-23［修回日期］2015-04-13

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1153-07

［中圖分類號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.001